曾婷婷，朱 衛(wèi)

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肛腸科，長(zhǎng)沙 410021）

潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)理尚未明確，其主要臨床特征以結(jié)腸彌漫性炎癥及直腸黏膜出血為主，是常見(jiàn)的腸系統(tǒng)紊亂疾病[1]。研究[2]表明，在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生過(guò)程中，IL-33/ST2 信號(hào)通路會(huì)協(xié)同免疫因子介導(dǎo)其免疫反應(yīng)，同時(shí)也會(huì)促進(jìn)炎癥因子的釋放，發(fā)揮炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，潰瘍性結(jié)腸炎屬于“泄瀉”“痢疾”“腸澼”范疇，該病病機(jī)為濕熱內(nèi)生、氣血瘀滯、內(nèi)蘊(yùn)腸腑，治療中以調(diào)和氣血、清熱燥濕為主，芍藥湯是治療該病的有效藥方[3-4]。本研究以IL-33/ST2 信號(hào)通路為接入點(diǎn)，探究芍藥湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的干預(yù)效果，以期為潰瘍性結(jié)腸炎的臨床治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 研究動(dòng)物 選購(gòu)50 只SPF 級(jí)SD 大鼠，均購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：YXK（京）2021-0013，體質(zhì)量（192.54±40.38）g，飼養(yǎng)嚴(yán)格依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理規(guī)定進(jìn)行，濕度控制在50%～65%，溫度控制在18～28℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

主要試劑與儀器：所有ELISA 試劑盒均購(gòu)自上海廣銳生物科技有限公司；5%TNBS 水溶液（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：P2297-5X10ML）；兔抗鼠免疫球蛋白A、CD4+T 淋巴細(xì)胞、亞型前列腺素過(guò)氧化物合成酶一抗，兔抗鼠β-肌動(dòng)蛋白一抗（武漢博士德生物公司，批號(hào)BC025782，BH071954，BG003453，BM0621）；水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20081206）；兔抗鼠分泌型免疫球蛋白一抗（上?？道噬锕荆?hào)KL8098）；白介素-33、ST2單克隆抗體（CST 公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）；顯微鏡（日本Nikon 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型構(gòu)建 分組：將50 只大鼠采取編號(hào)抽簽法隨機(jī)分為正常組（A 組）、潰瘍性胃炎模型組（B組）、低劑量芍藥湯組（C 組）、中劑量芍藥湯組（D組）、高劑量芍藥湯組（E 組），每組各10 只。造模：第2 周開始，予B 組、C 組、D 組、E 組大鼠灌服豬油（15 g/kg），每2 天1 次，并在灌服豬油的次日灌服52 度白酒，灌服21 d，然后禁食禁水24 h，于腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）令大鼠麻醉。向大鼠肛門8 cm 左右處插入甘油潤(rùn)滑硅膠管，向大鼠腸內(nèi)緩慢推入2.25 mL 100 mg/kg TNBS+50%乙醇，推入完成后，體尾倒置大鼠30 s，確保造模液在大鼠腸內(nèi)彌漫分布。造模完成后將大鼠仰臥送回籠中，待其自然蘇醒后選擇常規(guī)飼養(yǎng)方式飼養(yǎng)。參與造模的大鼠顯示大便次數(shù)增多、肛門污穢、大便末端有膿點(diǎn)和黏液出現(xiàn)，存在腹瀉現(xiàn)象，標(biāo)志造模成功。

1.2.2 給藥 造模成功后的第6 周開始給C 組、D 組、E 組灌胃，確定芍藥湯低、中、高劑量分別為5 g/kg、10 g/kg、20 g/kg 中藥煎劑量，每日1 次。A 組與B 組均予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組連續(xù)干預(yù)7 d。芍藥湯方藥組成：黃芩15 g，當(dāng)歸15 g，黃連15 g，生白芍30 g，肉桂5 g，木香6 g，大黃9 g，檳榔6 g，甘草6 g。藥材均購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)門診部，水提濃縮至每毫升2.0 g 生藥。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 樣本采集 治療結(jié)束后，第7 周所有大鼠禁食不禁水24 h，大鼠均使用10%水合氯醛以3.5 mL/kg的用量行腹腔注射，進(jìn)行麻醉，取大鼠腔內(nèi)靜脈血5 mL，高速離心，取上層血清。成功后將大鼠置于操作臺(tái)解剖大鼠，自肛門2 cm 處向上取結(jié)腸6～8 cm，截取3 塊大鼠結(jié)腸組織后置于生理鹽水中沖洗，將2塊組織石蠟包埋，制成4 μm 切片，一塊置于-80℃冰箱中凍存。

1.3.2 病理組織學(xué)觀察 取出包埋切片，進(jìn)行HE染色。于200 倍光鏡下，隨機(jī)選取切片視野，觀察各組大鼠、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、結(jié)腸上皮損傷等病理變化。

1.3.3 免疫球蛋白A（SIgA）、CD4+T 淋巴細(xì)胞、亞型前列腺素過(guò)氧化物合成酶（COX-2）表達(dá) 將大鼠腸組織切片取出，脫蠟、水合、滅活后進(jìn)行抗原修復(fù)，加入5%牛血清白蛋白，使其封閉20 min。加入1:500的SIgA、CD4+、COX-2 一抗，在37℃下孵育1 h，利用PBS進(jìn)行洗滌，加入1:2 000的二抗，孵育20 min 后顯色，復(fù)染，烘干封片，200 倍顯微鏡下觀察，并采集圖片。

1.3.4 血清內(nèi)皮素（ET）、白介素-4（IL-4）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測(cè)，取出凍存的血清標(biāo)本，在室溫中靜置30 min，根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書規(guī)定將標(biāo)準(zhǔn)品配置成需要濃度。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔和空白孔，依次向其中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)標(biāo)本品和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相關(guān)檢測(cè)抗體，孵育洗滌后用底物四甲基聯(lián)苯胺進(jìn)行染色，在酶標(biāo)儀450 nm 處讀取吸光度，繪制相關(guān)曲線，記錄標(biāo)本濃度。

1.3.5 IL-33、ST2 蛋白表達(dá) 采用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)大鼠結(jié)腸黏膜組織中IL-33、ST2 蛋白表達(dá)水平。將腸黏膜組織切成細(xì)小碎片，加入裂解液，混勻使其完全裂解，完成后取適量樣品，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測(cè)，經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜后，利用脫脂奶粉封閉，將IL-33、ST2抗體加入封閉液中，介質(zhì)進(jìn)行稀釋，在4℃環(huán)境中孵育12 h，加入HRP 標(biāo)記的二抗，將膜置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)，進(jìn)行掃描后在凝膠影像上分析條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠病理組織學(xué)觀察 A 組大鼠結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)清晰完整，且細(xì)胞排列整齊，腸腺細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，沒(méi)有水腫、充血現(xiàn)象，杯狀細(xì)胞數(shù)量較多，血管清晰可見(jiàn)。B組大鼠結(jié)腸組織黏膜缺失嚴(yán)重，細(xì)胞間質(zhì)血腫、充血明顯，且存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肉眼可見(jiàn)會(huì)發(fā)現(xiàn)潰瘍?cè)?。C 組、D 組、E 組結(jié)腸組織損傷程度不同，E 組結(jié)腸黏膜組織最為清晰，其次是D 組，細(xì)胞排列整齊程度也是E 組大于D 組大于C 組，C 組、D 組間質(zhì)水腫及充血現(xiàn)象較為明顯，仍有部分炎性細(xì)胞分布，腺體增生較為明顯，E組與A組基本形態(tài)無(wú)明顯差別。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠病理組織學(xué)觀察

2.2 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中SIgA、CD4+T 淋巴細(xì)胞、COX-2 表達(dá)比較 與A 組相比，B 組SIgA、CD4+T 淋巴細(xì)胞水平明顯降低，COX-2 水平明顯升高（P＜0.05）；與B 組相比，C 組、D 組、E 組SIgA、CD4+T 淋巴細(xì)胞水平明顯升高，COX-2 水平明顯降低，且E 組SIgA、CD4+T 淋巴細(xì)胞升高水平，COX-2 降低水平明顯優(yōu)于C 組、D 組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中SIgA、CD4+ T 淋巴細(xì)胞、COX-2 表達(dá)比較（，n =10）

表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中SIgA、CD4+ T 淋巴細(xì)胞、COX-2 表達(dá)比較（，n =10）

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與B 組比較，△P ＜0.05；與C 組比較，▲P ＜0.05；與D 組比較，□P ＜0.05

2.3 各組大鼠血清ET、IL-4、TNF-α 水平比較 與A組相比，B組ET、IL-4、TNF-α表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與B 組 相比，C 組、D 組、E 組ET、IL-4、TNF-α 表達(dá)明顯降低，且E 組ET、IL-4、TNF-α 降低幅度明顯優(yōu)于C 組、D 組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清ET、IL-4、TNF-α水平比較（，n = 10）

表2 各組大鼠血清ET、IL-4、TNF-α水平比較（，n = 10）

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與B 組比較，△P ＜0.05；與C 組比較，▲P ＜0.05；與D 組比較，□P ＜0.05

2.4 各組大鼠血清TGF-β1、ICAM-1 表達(dá)比較 與A組相比，B 組TGF-β1表達(dá)明顯降低，ICAM-1 表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與B 組相比，C 組、D 組、E組TGF-β1表達(dá)明顯升高，ICAM-1 表達(dá)明顯降低，且E 組TGF-β1/ICAM-1 升高/降低幅度明顯優(yōu)于C 組、D組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清TGF-β1、ICAM-1 表達(dá)比較（，n =10） μg/L

表3 各組大鼠血清TGF-β1、ICAM-1 表達(dá)比較（，n =10） μg/L

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與B 組比較，△P ＜0.05；與C 組比較，▲P ＜0.05；與D 組比較，□P ＜0.05

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織IL-33、ST2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與A 組相比，B 組IL-33、ST2 蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與B 組相比，C 組、D 組、E組IL-33、ST2 蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，且E 組IL-33、ST2 的相對(duì)表達(dá)量降低幅度明顯優(yōu)于C 組、D 組（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織IL-33、ST2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（，n =10）

表4 各組大鼠結(jié)腸組織IL-33、ST2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（，n =10）

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與B 組比較，△P ＜0.05；與C 組比較，▲P ＜0.05；與D 組比較，□P ＜0.05

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是較為嚴(yán)重的非特異性腸道炎癥疾病之一，屬于一種自身免疫性疾病，且反復(fù)發(fā)作[5-6]。當(dāng)前，臨床中對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療主要以緩解病情、降低發(fā)病頻次為主。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病病因尚未明確，其發(fā)病原因主要和免疫、遺傳、心理與環(huán)境等因素緊密相關(guān)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎屬于本虛標(biāo)實(shí)病癥[7]。芍藥湯可調(diào)和氣血、清熱燥濕，方中君藥芍藥柔肝斂陰、養(yǎng)血和營(yíng)，當(dāng)歸活血養(yǎng)血。臣藥檳榔行氣導(dǎo)滯、木香行氣寬中、甘草健脾和中，大黃與肉桂調(diào)和諸藥，諸藥合用氣血通達(dá)，濕熱得祛[8-9]。IL-33 是白細(xì)胞介素細(xì)胞因子，其受體是ST2，IL-33/ST2 通路會(huì)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[10-11]。IL-33/ST2 在受體輔助蛋白的作用下，會(huì)發(fā)揮促纖維化與促炎反應(yīng)，在潰瘍性結(jié)腸炎中對(duì)腸道黏液屏障的修復(fù)與腸道黏膜的保護(hù)有重要影響[12-13]。IL-33/ST2 通路也會(huì)參與腸上皮細(xì)胞生成，間接作用免疫反應(yīng)平衡[14]。

本研究結(jié)果顯示，采用芍藥湯治療的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織損傷減輕，間質(zhì)水腫及充血問(wèn)題得到改善，炎性細(xì)胞分布較少，且高劑量芍藥湯治療的大鼠病理特征改善最為顯著，其結(jié)腸組織基本形態(tài)和正常大鼠無(wú)太大差別。由此可知，芍藥湯有促進(jìn)結(jié)腸黏膜修復(fù)、延緩機(jī)體腸上皮細(xì)胞凋亡的功效，高劑量芍藥湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎治療效果最佳。

SIgA 有維持腸黏膜穩(wěn)態(tài)作用。CD4+T 細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，對(duì)免疫反應(yīng)有強(qiáng)度控制[15-16]。COX-2 屬于一種誘導(dǎo)型酶，是前列腺素過(guò)氧化物合成的亞型酶，對(duì)炎癥因子IL-33 有刺激作用，水平的升高也會(huì)讓機(jī)體發(fā)熱、水腫、腹痛、腹瀉程度增加[17]。本研究結(jié)果顯示，采用高劑量芍藥湯治療的大鼠SIgA、CD4+T 淋巴細(xì)胞水平升高，COX-2 水平降低最為顯著，可見(jiàn)芍藥湯可以抑制對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠炎癥反應(yīng)，改善其免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，采用芍藥湯治療的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠ET、IL-4、TNF-α 炎性因子、ICAM-1、COX-2 促炎因子表達(dá)明顯降低，TGF-β1抑炎因子表達(dá)明顯升高，高劑量芍藥湯上述指標(biāo)表達(dá)降低、升高程度最為顯著，提示芍藥湯可以改變炎癥因子趨化性，促進(jìn)抑炎因子表達(dá)。

研究[18]顯示，潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道間質(zhì)中IL-33 表達(dá)會(huì)升高。ST2 作為IL-33 的功能受體在巨噬細(xì)胞、Th2 細(xì)胞中表達(dá)廣泛，當(dāng)腸道組織細(xì)胞受損時(shí)IL-33 從凋亡細(xì)胞中得到釋放，IL-33ST2 通路可將信號(hào)從細(xì)胞外傳入細(xì)胞內(nèi)，介導(dǎo)并計(jì)劃下游的絲裂原活化蛋白激酶，促進(jìn)IL-4、TNF-α 炎性因子的合成，促使疾病進(jìn)程的發(fā)展[19]。IL-33ST2 會(huì)介導(dǎo)自殺殺傷T 細(xì)胞，并間接作用巨噬細(xì)胞及樹突細(xì)胞，阻礙TGF-β1、CD4+T 淋巴細(xì)胞的分泌，影響?zhàn)つけＷo(hù)作用的發(fā)揮[20]。SIgA 可聚集在潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜組織中，對(duì)免疫平衡的維持和腸上脾細(xì)胞的完整性有重要作用，SIgA 可能通過(guò)IL-33/ST2 介導(dǎo)來(lái)參與腸道黏膜穩(wěn)態(tài)的維持[21]。本研究結(jié)果顯示，采用芍藥湯治療的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-33、ST2 蛋白表達(dá)明顯降低，且高劑量芍藥湯治療的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-33、ST2 蛋白表達(dá)水平最為顯著，由此可以推測(cè)，芍藥湯會(huì)干預(yù)IL-33ST2 信號(hào)通路，下調(diào)其表達(dá)并抑制其促炎過(guò)程，調(diào)控IL-33/ST2 通路介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，激活相關(guān)免疫蛋白表達(dá)，修復(fù)黏液屏障，發(fā)揮黏膜保護(hù)機(jī)制，且高芍藥湯調(diào)控IL-33/ST2 信號(hào)通路效果更為顯著。

綜上所述，芍藥湯可以下調(diào)IL-33/ST2 表達(dá)，抑制IL-33/ST2 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，改善免疫反應(yīng)，減少腸黏膜病理?yè)p傷，發(fā)揮黏膜保護(hù)機(jī)制，治療潰瘍性結(jié)腸炎效果明顯。