劉遠婷，李 慧，丁甜甜，鄭 茜

（新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院中醫(yī)科，烏魯木齊 830026）

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）可視為胃癌（gastric carcinoma，GC）的癌前病變，在GC 的病理進展中起著重要作用[1]。中醫(yī)理論中，CAG屬于“胃萎”“痞滿”“胃脘痛”等范疇，臨床以胃陰不足等虛證多見。沙參麥冬湯有滋陰清肺，益胃生津之效。EGFR/MAPK 信號通路的異常激活在CAG 發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本實驗采用甲基硝基亞硝基胍（MNNG）建立CAG 大鼠模型，以不同劑量加味沙參麥冬湯灌胃干預，并探討其對EGFR/MAPK 信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar 大鼠 60 只，雄性，SPF 級，體質(zhì)量（160±20）g，飼養(yǎng)于SPF 級實驗動物房中，12 h 黑暗與照明交替，相對恒溫（22 ± 2）℃，恒濕75%。

1.2 實驗藥物及試劑 加味沙參麥冬湯方藥組成：北沙參12 g，玉竹10 g，麥門冬10 g，生扁豆10 g，天花粉15 g，桑葉6 g，生甘草3 g，白芍10 g，木瓜10 g。換算為大鼠灌胃等效劑量為9.68 g/kg，以此作為中劑量，高劑量為19.35 g/kg，低劑量為4.84 g/kg。維酶素片（每片0.2 g）購自河北環(huán)海藥業(yè)有限公司，N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）購自美國 Fluka 公司，GAS、SS、MTL 大鼠ELISA 試劑盒購自深圳達科為生物技術(shù)有限公司，抗ERF、EGFR、ERK1/2、p-ERK1/2及GAPDH 一抗購自美國 CST 公司，總RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa 公司。

1.3 模型建立及分組給藥 Wistar 大鼠按體質(zhì)量隨機分為空白組、模型組、陽性對照組、加味沙參麥冬湯低劑量組、加味沙參麥冬湯中劑量組、加味沙參麥冬湯高劑量組，每組各10 只?？瞻捉M大鼠正常飲食飲水，其余各組大鼠自由飲用MNNG 溶液制備CAG 模型[2]：MNNG 用蒸餾水配制為170 mg/L 的水溶液，灌于外涂黑漆的飲水瓶中，瓶中液體每日更換1 次，大鼠自由飲用8 周。病理學觀察以胃黏膜腺體數(shù)減少、固有腺體萎縮、腸上皮化生等病理形態(tài)學改變?yōu)樵炷３晒?。造模結(jié)束后，加味沙參麥冬湯低、中、高劑量組給予不同劑量（4.84、9.68、19.35 g/kg）灌胃治療，陽性對照組給予維酶素混懸液（0.3 g/kg）灌胃，每日1 次，持續(xù)治療12 周。

2 觀察指標

2.1 胃黏膜血流量檢測 治療結(jié)束后，各組隨機取5只大鼠采用中性紅清除法測定大鼠胃黏膜血流：大鼠禁食不禁水24 h，給予水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，經(jīng)尾靜脈取血1 mL 置于抗凝管，沿右腹股溝做一切口，分離股靜脈與股動脈，經(jīng)十二指腸向胃插入軟管，收集大鼠胃液0.5 mL 作為對照，然后沿右股靜脈注射2 mL 中性紅生理鹽水溶液（4 mg/kg），約4 min 注射完，再用微量注射泵以恒速輸注4 mL 維持量的中性紅溶液[4 mg/（kg·hr）]，每 15 min 收集1 次胃液，共收集 2 h，實驗末取血4 mL，分光光度計于540 nm 測定胃液和血液樣本的中性紅濃度，胃黏膜血流量（GMBF）=胃液中性紅濃度/血液中性紅濃度×單位時間內(nèi)胃液分泌量。

2.2 胃黏膜病理形態(tài)學觀察 各組另5 只大鼠腹主動脈取血后處死并取胃組織，沿胃大彎剪開，取部分胃黏膜組織置于10 %多聚甲醛溶液中固定48 h，經(jīng)常規(guī)脫水、二甲苯透明后進行石蠟包埋，切片機作5 μm 厚切片，再經(jīng)60℃烘片、脫蠟至水、蘇木素-伊紅（HE）染色、鹽酸酒精分化、脫水和透明后用中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察大鼠胃黏膜組織形態(tài)學改變并拍照。

2.3 血清GAS、SS、MTL 水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠血清中GAS、SS、MTL 水平。大鼠腹主動脈取血，3 000 r/min 離心15 min 后取血清，置于-20 ℃冰箱保存待測。血清臨測前置于常溫下平衡1 h 后，3 000 r/min 離心15 min，嚴格按照試劑盒說明書配制試劑及標準品，各樣品孔分別加入血清樣品10 μL，樣品稀釋液40 μL 和抗體100 μL，于37 ℃孵育1 h，洗滌劑清洗6 次，每孔加入顯色液100 μL，于37℃避光孵育15 min，再加入終止液50 μL，于酶標儀450 nm 檢測各孔OD 值。建立標準曲線，代入OD 值得出各血清樣本中GAS、SS、MTL 的水平。

2.4 Western-blot 檢測胃黏膜組織ERF、EGFR、ERK1/2、p-ERK1/2 的蛋白表達 取大鼠部分胃黏膜組織，4 ℃預冷生理鹽水清洗2 次，無菌剪剪碎后勻漿，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA 法測定總蛋白濃度。將10 μL 蛋白加入進樣孔，經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)膜，取出PVDF 膜，用 5% TBST 脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST清洗后加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次，加入二抗室溫下孵育1 h，滴加顯色液顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光并拍照，用Image J 軟件分析各條帶灰度值，經(jīng)內(nèi)參校正后進行統(tǒng)計學分析。

2.5 RT -PCR 檢測胃黏膜組織ERF、EGFR、p-ERK1/2的mRNA 表達 取大鼠部分胃黏膜組織，采用Trizol一步法提取組織總RNA，紫外分光光度儀測定總RNA濃度并逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，再進行PCR 擴增。反應條件為94 ℃ 預變性5 min，95 ℃ 變性30 s，退火溫度為60 ℃ 30 s，72℃ 延伸 30 s，共擴增 40 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。以 GAPDH 為內(nèi)參，結(jié)果以 2-△△Ct法分析相對mRNA 表達量。各基因引物序列見表 1。

表1 各基因引物序列

2.6 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 20.0 軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均值±標準差（）表示，2 組以上數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠胃黏膜血流量比較 見表2。

表2 各組大鼠胃黏膜血流量比較（，n =5）mg/（kg·hr）

表2 各組大鼠胃黏膜血流量比較（，n =5）mg/（kg·hr）

注：與空白組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△ P ＜0.05，△△ P ＜0.01

3.2 各組大鼠胃黏膜病理表現(xiàn)比較 HE 染色可見，空白組大鼠胃黏膜腺體排列規(guī)律，黏膜未見損傷；模型大鼠胃腺數(shù)量較空白組明顯減少，腺體可見萎縮，黏膜變薄，黏膜上皮可見部分腸上皮化生，胃固有層可見漿細胞和淋巴細胞浸潤。加味沙參麥冬湯明顯減輕了大鼠胃黏膜的病理表現(xiàn)，且治療效果呈劑量依賴性，可見隨給藥劑量的增大，大鼠胃黏膜腺體排列逐漸規(guī)律，胃黏膜增厚，胃腺數(shù)量增多。見圖 1。

圖1 各組大鼠胃黏膜病理形態(tài)學改變（HE，×200）

3.3 各組大鼠血清中GAS、SS、MTL 的水平比較 見表3。

表3 各組大鼠血清中GAS、SS、MTL 水平比較（，n =5）

表3 各組大鼠血清中GAS、SS、MTL 水平比較（，n =5）

注：與空白組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△ P ＜0.05，△△ P ＜0.01

3.4 各組大鼠胃黏膜組織EGFR/MAPK 通路相關(guān)蛋白表達水平比較 各組ERK1/2 的蛋白表達與空白組相比未見明顯差異（P＞ 0.05），模型組大鼠胃黏膜組織中EGF、EGFR、p-ERK1/2 的表達水平較空白組顯著升高（P＜0.01），經(jīng)加味沙參麥冬湯低、中、高劑量組治療后，大鼠EGF、EGFR、p-ERK1/2 的蛋白表達較模型組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），且效果呈劑量依賴性。見圖 2。

圖2 各組大鼠胃黏膜組織EGFR/MAPK 通路蛋白表達水平

3.5 各組大鼠胃黏膜組織EGFR/MAPK 通路mRNA表達水平比較 見表 4。

表4 各組大鼠胃黏膜組織EGF、EGFR、p-ERK1/2 mRNA 表達（，n =3）

表4 各組大鼠胃黏膜組織EGF、EGFR、p-ERK1/2 mRNA 表達（，n =3）

注：與空白組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△ P ＜0.05，△△ P ＜0.01

4 討論

CAG 胃陰虛證為臨床常見證型。本病病情遷延，往往耗傷胃陰，故以胃陰不足為發(fā)病根本，熱毒、氣滯、痰濁、血瘀等可隨之郁阻，而致胃土陰傷，胃絡失和，胃體失養(yǎng)，萎弱不用而致病[3]。胃為燥土，喜潤而惡燥，治療當以滋陰益胃為原則。沙參麥冬湯為《溫病條辨》中清養(yǎng)肺胃的代表方，有滋陰清肺，益胃生津之效。臨床研究[4-6]證明，沙參麥冬湯用于治療CAG、慢性淺表性胃炎等慢性胃病均具有滿意療效，提示其作為阻斷CAG 進展的潛在藥物值得進一步深入研究。

本實驗結(jié)果顯示，加味沙參麥冬湯能夠明顯增加CAG 大鼠胃黏膜血流量，減輕黏膜組織損傷，治療作用呈劑量依賴性，提示加味沙參麥冬湯能夠通過改善胃黏膜血流量而增強黏膜上皮保護功能，維護大鼠胃黏膜屏障功能，促進胃黏膜損傷的修復。胃泌素（GAS）、生長抑素（SS）和胃動素（MTL）等胃腸激素對胃黏膜完整性、胃酸的分泌及胃腸道運動具有重要的調(diào)節(jié)作用[7]。ELISA 結(jié)果表明，模型組大鼠血清GAS、SS 水平均降低，MTL 水平升高，可能由于大鼠胃黏膜腺體萎縮，數(shù)量減少所致，加味沙參麥冬湯治療后劑量依賴性地上調(diào)了大鼠血清GAS、SS 水平，下調(diào)了MTL 水平，提示加味沙參麥冬湯可通過調(diào)節(jié)胃腸激素的分泌，改善大鼠胃黏膜血流量，減輕胃黏膜損傷。

表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）是一種多效生長因子，在調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和分化中發(fā)揮重要作用[8]。研究[9-10]證實，EGF 及其受體表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）參與CAG 及GC 的發(fā)生和轉(zhuǎn)化過程。CAG 在慢性炎癥刺激狀態(tài)下過度表達EGFR，EGFR 與EGF結(jié)合，引起胃黏膜上皮細胞分化和增殖異常，胃黏膜腸上皮化生和異型增生。本研究結(jié)果顯示，加味沙參麥冬湯灌胃治療后，胃黏膜組織EGF、EGFR 的表達較模型組顯著降低，提示加味沙參麥冬湯可通過抑制EGF 和EGFG 的表達，有效減輕大鼠胃黏膜細胞增殖異常。EGFR 與EGF 特異性結(jié)合后，可激活有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路從而實現(xiàn)對GC 發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)[11]。胞外信號相關(guān)激酶（extracellular signal-related kinase，ERK）是MAPK 通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，能夠?qū)⑿盘枏募毎鬟f到細胞質(zhì)，其異常激活能夠促進CAG 胃黏膜細胞異常增殖及GC 細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[12]。p-ERK1/2是ERK1/2 的活化形式，在本實驗中，模型組p-ERK1/2的蛋白和mRNA 表達均明顯增高，加味沙參麥冬湯各劑量組均下調(diào)了p-ERK1/2 的表達水平，其中高劑量組降低最明顯，提示加味沙參麥冬湯可能通過調(diào)控EGFR/MAPK 信號通路發(fā)揮對CAG 的治療作用。

綜上所述，加味沙參麥冬湯可顯著改善CAG 大鼠胃黏膜血流量，減輕胃黏膜損傷，能夠有效抑制EGFR/MAPK 信號通路的異常激活，這可能是其改善CAG 胃黏膜癥狀的作用機制之一。