董小偉 郭卉欣 張晨晨 王嘉雯 何俊磊 李觀海 李建偉 溫文沛

為減少學(xué)校結(jié)核病疫情的發(fā)生，國家衛(wèi)生健康委員會和教育部門要求將結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染檢測納入高中及以下學(xué)生人群健康體檢必檢項(xiàng)目［1-3］。當(dāng)前，MTB感染的篩查沒有一致的共識，主要方法有結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（tuberculin skin test，TST）和γ-干擾素釋放試驗(yàn)（interferon-γrelease assays，IGRA）［4］。其 中，TST檢測操作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，應(yīng)用最廣，為學(xué)校結(jié)核分枝桿菌潛伏感染（LTBI）篩查和結(jié)核病患者的主動發(fā)現(xiàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，但其檢測結(jié)果的特異性具有明顯局限性［5］；而IGRA 的特異度雖大大提高，但技術(shù)要求高，操作復(fù)雜，且費(fèi)用較高，也是限制其廣泛應(yīng)用的主要問題。鑒于TST和IGRA各具優(yōu)勢，越來越多的研究建議將兩者聯(lián)合應(yīng)用，即在TST檢測陽性后再聯(lián)合IGRA檢測，稱之為MTB感染檢測“兩步法”，以降低檢測成本并提高檢測特異度。

為評估學(xué)生人群MTB感染水平，以及預(yù)防性服藥治療的有效性和安全性，廣東省結(jié)核病控制中心于2017年開始承擔(dān)“十三五”國家科技重大專項(xiàng)課題結(jié)核病重點(diǎn)人群干預(yù)策略研究——學(xué)生人群潛伏感染干預(yù)技術(shù)的科研任務(wù)，先后在廣州、佛山、陽江和汕尾等地市的初中、高中和大學(xué)等各個(gè)層級學(xué)校開展了大規(guī)模學(xué)生人群TST、IGRA 和胸部X線攝片（簡稱“胸片”）檢查，并進(jìn)一步對TST和IGRA均陽性且排除活動性肺結(jié)核的學(xué)生人群作為LTBI者開展預(yù)防性服藥治療的隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)研究?，F(xiàn)筆者通過分析TST 和IGRA 對MTB感染檢測的一致性，分析二者優(yōu)劣，初步評估“兩步法”在學(xué)校結(jié)核病篩查中的作用，為學(xué)校有效開展MTB感染檢測和肺結(jié)核篩查提供一種可行的思路和參考。

對象和方法

一、研究對象

采用橫斷面研究方法，從上述課題中選取2017—2021年廣東省有TST和IGRA 檢測及胸片等結(jié)核病檢查項(xiàng)目的74 358名學(xué)生資料進(jìn)行分析。其中，男性40007名（53.80%），女性32987名（44.36%），性別資料缺失1364名（1.84%）；平均年齡為（16.0±2.5）歲，14 歲及以下16 129 名（21.69%），15～17歲34 551名（46.47%），18歲及以上21 161名（28.46%），年齡資料缺失者2517名（3.38%）；50 701 名（68.18%）完成了胸片篩查；74 148 名（99.72%）完成了TST篩查；9702名（13.08%）TST陽性者進(jìn)一步完成IGRA檢測。

二、研究方法

1.TST檢測：試驗(yàn)試劑采用成都生物制品研究所有限責(zé)任公司的卡介苗純化蛋白衍生物（purified protein derivative of tuberculin of Bacillus，BCGPPD），由統(tǒng)一培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員于學(xué)生左前臂掌側(cè)1/3中央皮內(nèi)注射5 IU BCG-PPD，72 h 后檢查TST反應(yīng)，測量皮膚硬結(jié)平均直徑。以硬結(jié)平均直徑＜5 mm或無反應(yīng)者為陰性，5～＜10 mm 為一般陽性，10～＜15 mm 為中度陽性，≥15 mm 或局部出現(xiàn)雙圈、水皰、壞死及淋巴管炎者為強(qiáng)陽性。依據(jù)《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范性附錄D—結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，本研究以硬結(jié)平均直徑≥10 mm為MTB感染判定標(biāo)準(zhǔn)。

2.IGRA 檢測：采用T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)法（T-SPOT.TB），試劑采用廣東體必康生物科技有限公司生產(chǎn)的T-SPOT.TB試劑盒并嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采集靜脈血6 ml，肝素抗凝，淋巴細(xì)胞分離液分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）并制備成濃度為2.5×106/ml的細(xì)胞懸液。每份測試樣本需要4個(gè)檢測孔，以細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對照、植物血凝素（PHA）作為陽性對照、MTB早期分泌抗原靶6（ESAT-6）和培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP-10）作為特異性刺激抗原，每孔加入0.1 ml制備好的細(xì)胞懸液，將微孔板放在含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日洗板后加入生物素標(biāo)記的抗體（小鼠抗人γ-干擾素單抗）于2～8℃反應(yīng)1 h，洗板后加入顯色底物液室溫靜置7 min，去離子水終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。使用酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀計(jì)數(shù)著色的斑點(diǎn)，每1個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)分泌γ-干擾素（IFN-γ）的T淋巴細(xì)胞，并按照說明書的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。連續(xù)性變量經(jīng)正態(tài)性檢測后，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用“”描述；計(jì)數(shù)資料采用“百分率（%）”描述，組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？紤]到IGRA 是采用卡介苗及大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌缺失的ESAT-6和CFP-10等作為抗原刺激物，具有良好的特異性；本研究以IGRA檢測結(jié)果為MTB 感染檢測效能的參照標(biāo)準(zhǔn)，分別評估TST 和“兩步法”檢測對學(xué)生人群MTB感染和活動性肺結(jié)核的篩查效果。采用Kappa檢驗(yàn)評價(jià)兩種檢測結(jié)果的一致性，Kappa值≥0.75為兩者一致性較好、0.4～＜0.75為兩者一致性一般、＜0.4為一致性較差。

結(jié)果

一、TST和IGRA篩查情況

74 148名（99.72%）學(xué)生完成了TST 篩查，結(jié)果顯示：陰性51 114名（68.93%）、一般陽性14 382名（19.40%）、中度陽性7111名（9.59%）、強(qiáng)陽性1541名（2.08%）；TST 檢測陽性率為31.07%，強(qiáng)陽性率為2.08%。結(jié)合個(gè)人意愿及陽性情況，對9702名（13.08%）TST 檢測陽性者進(jìn)一步開展IGRA檢測，發(fā)現(xiàn)陽性者887名（9.14%）。最終經(jīng)胸片和病原學(xué)檢查診斷為活動性肺結(jié)核患者17例（圖1）。不同學(xué)習(xí)階段學(xué)生人群TST 和IGRA 篩查結(jié)果分布情況見表1。

圖1 研究對象經(jīng)TST和IGRA篩查和診斷結(jié)果

二、TST和IGRA檢測MTB感染一致性比較

9702名學(xué)生同時(shí)完成了TST 和IGRA 試驗(yàn)，以IGRA檢測結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，以TST硬結(jié)平均直徑5、10和15 mm 為陽性臨界值時(shí)，兩種篩查方法的一致率分別為15.97%、26.63%和81.11%，Kappa值分別為0.014、0.014和0.112。TST 檢測MTB感染的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值見表2。

表2 以IGRA檢測結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)不同陽性臨界值下TST對MTB感染的檢測效能

三、TST和“兩步法”檢測MTB 感染情況的比較

完成TST檢測的74 148名學(xué)生中，TST 檢測MTB 感染率（11.67%）明顯高于“兩步法”（1.02%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體見表3。

表3 TST和兩步法判定74 148名學(xué)生人群MTB感染情況

四、TST和“兩步法”檢測肺結(jié)核能力的比較

最終共確診篩查學(xué)生肺結(jié)核患者17例，包括病原學(xué)陽性9 例、病原學(xué)陰性8 例。其中，5219 名TST中陽或強(qiáng)陽者經(jīng)胸片、病原學(xué)等檢查確診肺結(jié)核15 例，患者檢出率為0.29%；759 名TST 和IGRA 雙陽者經(jīng)胸片和病原學(xué)等檢查確診肺結(jié)核14例，患者檢出率為1.84%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=30.133，P＜0.001）。同時(shí)，兩步法對肺結(jié)核的檢出率也高于TST強(qiáng)陽者檢出率，兩者間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.860，P=0.015），具體見表4。

表4 TST和兩步法對肺結(jié)核檢出率的比較

討 論

學(xué)校是人群密集場所，易發(fā)生結(jié)核病疫情，甚至是突發(fā)公共衛(wèi)生事件，影響社會穩(wěn)定；而新生入學(xué)體檢進(jìn)行結(jié)核病篩查，可及早發(fā)現(xiàn)傳染源，實(shí)現(xiàn)防控關(guān)口前移，避免校園內(nèi)傳播。國家衛(wèi)生健康委員會和教育部門陸續(xù)發(fā)文要求對MTB感染篩查中發(fā)現(xiàn)的TST強(qiáng)陽性或IGRA 陽性者進(jìn)一步開展胸片等結(jié)核病相關(guān)檢查，并建議有肺結(jié)核患者密切接觸史或其他高危因素時(shí)進(jìn)行預(yù)防性服藥治療［1-3］。在這種背景下，在學(xué)生人群中開展TST 和IGRA 檢測MTB感染的一致性研究十分必要。

本研究發(fā)現(xiàn)，學(xué)生人群中TST 和IGRA 對于MTB感染的檢測一致率較差，與既往研究結(jié)論基本一致［6-8］。Li等［6］研究發(fā)現(xiàn)5～15歲兒童和青少年中，TST與IGRA 對MTB感染檢測的一致率為88.0%，Kappa值為0.125；祁雪等［7］曾對19 093例年齡＜15 歲的住院兒童進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)TST 與IGRA檢測MTB感染的一致率為95.2%～97.5%；Kappa值為0.17～0.19。本研究以IGRA 檢測結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，在以TST檢測硬結(jié)平均直徑10 mm為陽性臨界值、在保證較高敏感度的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)兩步法檢測可大幅提高TST檢測特異度，與既往研究基本一致［9］；同時(shí)，TST和IGRA檢測MTB感染的一致率，以及TST陽性臨界值設(shè)定為5 mm/10 mm時(shí)TST 的特異度等兩項(xiàng)指標(biāo)均低于既往研究水平［9］，可能與本研究兩步法檢測納入了TST＜5 mm一致率較高學(xué)生人群的比例過少有關(guān)。

本研究首次驗(yàn)證了在學(xué)生人群中開展MTB感染檢測“兩步法”的可行性。本研究在學(xué)生健康體檢中，首先開展TST檢測，然后進(jìn)一步對TST中陽及強(qiáng)陽的人群進(jìn)行IGRA檢測，發(fā)現(xiàn)1.02%的學(xué)生呈現(xiàn)雙陽性，對比TST 檢測將中陽及強(qiáng)陽性者（11.67%）判定為MTB感染者，大幅縮小了MTB感染和預(yù)防性服藥治療對象的判定范圍，認(rèn)為“兩步法”提高了檢測MTB感染的精準(zhǔn)性?？紤]與IGRA排除了TST檢測中因卡介苗和部分非結(jié)核分枝桿菌影響致假陽性有關(guān)。這與既往研究觀點(diǎn)一致。高磊等［10］曾于2020年探討過在中國學(xué)生人群中，在常規(guī)入學(xué)體檢工作中可結(jié)合當(dāng)?shù)貙?shí)際條件選擇TST+IGRA兩步法以提高檢測MTB感染的特異度，減少假陽性，并在控制成本的前提下盡可能準(zhǔn)確界定患者發(fā)現(xiàn)的目標(biāo)人群，提高工作可行性。目前，普遍認(rèn)為在卡介苗接種率高的國家，TST 檢測MTB感染時(shí)可導(dǎo)致假陽性結(jié)果，從而過高估計(jì)感染負(fù)擔(dān)［6，11］?！皟刹椒ā笨蓽p少TST 假陽性結(jié)果造成的不必要的后續(xù)患者發(fā)現(xiàn)和預(yù)防干預(yù)資源投入，是符合成本效益的篩查策略［12-15］，已被眾多國家列為MTB 感染檢測策略納入國家結(jié)核病防控指南［16-21］。目前，筆者也在對經(jīng)TST判定和兩步法判定且通過胸部影像學(xué)等檢查已排除活動性肺結(jié)核的LTBI者進(jìn)行登記隨訪追蹤，比較各自后續(xù)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

針對“雙陽者”再進(jìn)一步開展胸片、結(jié)核病病原學(xué)等檢查，在保證肺結(jié)核患者發(fā)現(xiàn)比例的基礎(chǔ)之上，可大幅提高患者檢出率。若按照當(dāng)前衛(wèi)生部門和教育部門印發(fā)的相關(guān)規(guī)范［1-2］，新生入學(xué)體檢中僅對篩查發(fā)現(xiàn)的TST強(qiáng)陽者開展進(jìn)一步檢查，則只能檢出8例學(xué)生肺結(jié)核患者；若對兩步法篩查發(fā)現(xiàn)的雙陽者進(jìn)一步開展檢查則可檢出肺結(jié)核14例，從患者發(fā)現(xiàn)數(shù)量來看，兩步法顯示出了優(yōu)勢。故認(rèn)為“兩步法”可大大減少胸片的使用，降低了X 線輻射對學(xué)生人群身體健康的損害。

本研究有以下局限性：首先，本研究有99.72%的學(xué)生完成了TST篩查，但僅68.18%同時(shí)完成了胸片檢查，無法獲取學(xué)生人群中肺結(jié)核患者總數(shù)，無法計(jì)算通過兩步法發(fā)現(xiàn)的肺結(jié)核患者數(shù)占肺結(jié)核患者總數(shù)的比例（即發(fā)現(xiàn)能力）。其次，IGRA 對檢測條件和技術(shù)的要求相對更高，操作程序相對復(fù)雜，且費(fèi)用昂貴。即使在第一步的TST篩查后已大大減少了IGRA篩查的對象數(shù)量，但在大規(guī)模學(xué)生人群篩查使用時(shí)還需綜合權(quán)衡考量。

綜上，TST和IGRA 檢測MTB感染的一致性差，兩步法檢測可大幅提高M(jìn)TB感染的精準(zhǔn)性和篩查肺結(jié)核患者的效率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)董小偉：實(shí)施研究，整理分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；郭卉欣：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究；張晨晨和何俊磊：實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)；王嘉雯：采集數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析；李觀海：采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)；李建偉：分析/解釋數(shù)據(jù)，指導(dǎo)研究實(shí)施；溫文沛：獲取研究經(jīng)費(fèi)，指導(dǎo)研究實(shí)施和論文修改