李雪梅 鄒東梅 孫雪靜 李霞 趙義 孫婉玲★

特發(fā)性免疫性血小板減少癥（Idiopathic im?mune thrombocytopenia，ITP）是臨床中原發(fā)性免疫性血小板減少癥的代表，結(jié)締組織?。–onnective tis?sue disease，CTD）繼發(fā)血小板減少（CTD?TP）是最常見的繼發(fā)性免疫性血小板減少，是繼發(fā)性免疫性血小板減少癥的代表。研究顯示調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regula?tory T cells，Treg）在維持人體的免疫耐受中發(fā)揮重要作用［1］，Treg 減少也參與多種結(jié)締組織病的發(fā)?。?］。同樣，在ITP 發(fā)病機制中，細(xì)胞免疫異常也具有更重要的作用［3］。Sylvain 等［4］發(fā)現(xiàn)ITP 患者體內(nèi)自身反應(yīng)性T 細(xì)胞增殖，刺激自身反應(yīng)性B 細(xì)胞的增殖和分化，從而產(chǎn)生抗血小板自身抗體，導(dǎo)致血小板減少。為了探索免疫性血小板減少患者中免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子水平的變化規(guī)律，本研究同時納入非免疫機制介導(dǎo)的血液系統(tǒng)疾病合并血小板減少（Hematological disease related thrombocytopenia，HD?TP）患者為研究組，比較各組外周血Treg、淋巴細(xì)胞亞群、血漿細(xì)胞因子譜水平的差異，從而進一步了解免疫性血小板減少的發(fā)病機制?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年1月至2022年2月首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院收治的不同病因?qū)е碌难“鍦p少患者61 例作為病例組，按照血小板減少的不同病因分為CTD?TP 組21 例，男5 例、女16 例，年齡（55.1±19.7）歲；ITP 組20 例，男6 例、女14 例，年 齡（52.55±20.3）歲；包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）12 例，原發(fā)性干燥綜合（Primary sjogren's syndromejavascript：PSS）9 例；ITP 組20 例，有抗核抗體（Antinuclear antibodies，ANA）陽性6 例。HD?TP 組20 例，男8 例、女12例，年齡（58.1±18.5）歲。全部為急性髓系白血?。ˋcute myeloid leukemia，AML）患者。收集患者的一般資料，包括年齡、性別、病程，外周血Treg，淋巴細(xì)胞亞群，血漿細(xì)胞因子，血小板計數(shù)等指標(biāo)。另選擇同期健康體檢者30 名作為正常對照組，男3 例、女27 例，年齡（48.17±15.0）歲。四組間性別、年齡、病程、嚴(yán)重出血情況及合并用藥比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。所有研究對象或家屬對本研究知情并簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)包括：①符合結(jié)締組織病診斷標(biāo)準(zhǔn)［5?6］；符合ITP 診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；符合血液系統(tǒng)腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］；②年齡大于18 歲；③病例組入組需滿足血小板小于100×109/L，健康對照組需滿足血小板大于100×109/L（兩次不同日、間隔一周檢測結(jié)果）；④患者資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①合并惡性腫瘤（除外符合血液病入組病例）；②嚴(yán)重感染，肝脾腫大，嚴(yán)重肝腎功能不全，其他繼發(fā)性血小板減少，哺乳期、妊娠期女性。本研究已通過本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集

患者空腹12 h，采血前1 天禁忌暴飲暴食和劇烈運動，在患者平靜狀態(tài)下用EDTA 抗凝管抽取靜脈血4 mL。

1.2.2 指標(biāo)檢測

1.2.2.1 外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測 絕對計數(shù)管中加入50 μL EDTA 抗凝外周血和混合抗體20 μL，包括BD 公司CD3?FITC、CD45?PerCP?Cy5.5、CD4?PE?Cy7、CD56?PE、CD16?PE、CD19?APC、CD8?APC?Cy，充分震蕩混勻，常溫避光孵育20 分鐘，加入450 μL 紅細(xì)胞裂解液，離心、洗滌后上機常規(guī)檢測淋巴細(xì)胞亞群絕對計數(shù)。流式細(xì)胞儀為BD FACS AriaⅡ。CD3+細(xì)胞為總T 細(xì)胞，其中CD4+T 細(xì)胞為輔助T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞為抑制T 細(xì)胞；CD19+細(xì)胞為總B 細(xì)胞；CD3?CD16+CD56+細(xì)胞為NK 細(xì)胞。

1.2.2.2 外周血Treg 檢測 取100 μL EDTA 抗凝外周血熒光抗體標(biāo)記Treg，所用抗體包括BD 公司HLA?DR? FITC、CD4?PE?Cy7、CD45?PerCP?Cy5.5和BD Phamingen 公司CD25?PE、CD127? PE?Cy7，標(biāo)本處理過程同前。CD3+CD4+CD25+CD127?細(xì)胞為外周血總Treg 細(xì)胞，測定Treg 細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例。射門策略見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)外周血Treg 射門策略Figure 1 Gating strategy of Treg by flow cytometry

1.2.2.3 外周血細(xì)胞因子檢測 細(xì)胞因子試劑盒購自江西賽基生物技術(shù)有限公司，檢測方法為多重?zé)晒饷庖呶⑶蚍?，所測細(xì)胞因子包括：IL?1β、IL?2、IL?4、IL?5、IL?6 、IL?8 、IL?10、IL?12P70 、IL?17A、IFN?γ、TNF?α 、IFN?α。EDTA 抗凝外周血離心后取上清血漿，按照說明書步驟進行處理，BD FACS Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血漿標(biāo)本中各細(xì)胞因子水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用n（%）表示，行χ2檢驗。計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD?t檢驗；不符合正態(tài)分布資料采用非參數(shù)檢驗，組間比較采用Kruskal?Wallis 秩和檢驗（H檢驗）。外周血Treg、淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子與不同病因血小板減少病例組血小板水平關(guān)系，采用Pearson相關(guān)性分析。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者基線臨床資料比較

各組年齡、性別、病程、嚴(yán)重出血情況及合并用藥，基線比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。對照組血小板計數(shù)顯著高于三組研究組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組基線臨床資料比較［（±s），n（%）］Table 1 Comparison of baseline clinical data in each group［（±s），n（%）］

表1 各組基線臨床資料比較［（±s），n（%）］Table 1 Comparison of baseline clinical data in each group［（±s），n（%）］

注：AML：急性髓系白血病，GC：糖皮質(zhì)激素；IS：免疫抑制劑；R：利妥昔單抗，SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；pSS：原發(fā)性干燥綜合征；ANA：抗核抗體。

性別年齡（歲）疾病分類病程（年）血小板（×109/L）嚴(yán)重出血合并用藥女性男性CTD?TP（n=21）16（76）5（24）55.1±19.7 SLE 12（57）pSS 9（43）4.53±3.0 28.35±15.6 3（14）GC 16（76）IS 18（86）ITP（n=20）14（70）6（30）52.55±20.3 ANA+ 6（30）5.15±4.29 35.45±12.3 4（20）GC 14（70）R 8（40）HD?TP（n=20）12（60）8（40）58.1±18.5 AML 20（100）6.9±5.28 27.6±14.7 4（20）GS 17（85）IS 18（90）對照組（n=30）27（90）3（10）48.17±15 4.97±3.78 218±56.93 F/Z 值2.175 1.333 1.167 60.9 1.231 1.388 P 值0.097 0.269 0.327 0.000 0.317 0.251

2.2 各組外周血Treg、淋巴細(xì)胞亞群比較

CTD?TP 組和ITP 組的Treg 在CD4+T 細(xì)胞中的比例均低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；HD?TP 組的Treg 高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；CTD?TP 組和HD?TP 組的總T細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞絕對計數(shù)均明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；ITP組總T 細(xì)胞高于HD?TP 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組外周血Treg 和淋巴細(xì)胞亞群比較（±s）Table 2 Comparison of peripheral blood Treg cells and Lymphocyte subsets between groups with different causes of thrombocytopenia（±s）

表2 各組外周血Treg 和淋巴細(xì)胞亞群比較（±s）Table 2 Comparison of peripheral blood Treg cells and Lymphocyte subsets between groups with different causes of thrombocytopenia（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與HD?TP 組比較，bP<0.05；與ITP 組比較，cP<0.05。

組別Treg/CD4+T（%）總T 細(xì)胞（/μL）CD8+T 細(xì)胞（/μL）CD4+T 細(xì)胞（/μL）NK 細(xì)胞（/μL）B 細(xì)胞（/μL）CTD?TP 組（n=21）4.89±1.38abc 908±366abc 379±377abc 464±192abc 120±86.55abc 212±7.45abc ITP 組（n=20）5.74±1.42ab 1 101±512ab 371±180ab 622±333ab 242±163ab 183±127ab HD?TP 組（n=20）8.58±1.59a 806±318a 314±207a 453±219a 122±93a 122±79.55a對照組（n=30）6.59±2.11 1 293±377 483±203 711±240 362±220 210±86.2 F 值17.059 7.189 2.339 6.081 12.942 3.206 P 值0.000 0.000 0.23 0.001 0.000 0.027

2.3 不同組間外周血細(xì)胞因子結(jié)果

CTD?TP 組IL?6，IL?8 高于對照組，ITP 組IL?6，IL?8，IL?10，IL?1β，IL?17A，IFN?α，IL?12P70 高于對照組，HD?TP 組IL?8，IL?10 高于對照組，CTD?TP組IL?8，IL?1β，IL?12P70，IL?17A 低于ITP 組，ITP組IL?17A，IL?12P70 高于HD?TP 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 不同病因組間的外周血細(xì)胞因子比較（pg/mL，±s）Table 3 Comparison of peripheral blood cytokines between different etiological groups（pg/mL，±s）

表3 不同病因組間的外周血細(xì)胞因子比較（pg/mL，±s）Table 3 Comparison of peripheral blood cytokines between different etiological groups（pg/mL，±s）

注:與對照組比較，aP<0.05;與ITP 組比較，bP<0.05；與HD?TP 組比較，cP<0.05。

指標(biāo)IL?2 IL?4 IL?5 IL?6 IL?8 IL?1β IL?17A IL?10 TNF?α IFN?α IL?12P70 IFN?γ CTD?TP 組(n=21)1.5±0.86 2.1±1.33 0.58±0.38 8.75±7.93a 5.5±2.28ab 1.78±1.25b 13.99±8.06b 1.93±0.65 1.52±0.93 1.91±1.17 2.38±1.82b 1.57±0.96 ITP 組(n=20)1.57±0.77 1.54±0.69 0.96±0.51 13.56±4.06a 10.19±5.33a 3.39±1.61a 16.34±7.14ac 4.27±3.6a 1.75±0.85 3.49±1.97a 3.93±1.27ac 2.13±1.04 HD?TP 組(n=20)0.99±0.72 1.37±0.97 0.55±0.32 5.79±3.48 7.09±3.99a 2.36±2.01 8.98±5.15 2.22±0.82a 2.05±1.24 1.89±1.23 2.81±0.34 1.95±0.63對照組(n=30)1.10±1.05 1.61±1.13 0.79±0.56 2.50±1.63 3.43±1.65 1.31±1.17 8.23±5.49 1.68±0.93 1.37±1.19 1.16±0.86 1.71±1.14 1.86±1.15 F 值2.22 1.75 3.52 8.50 16.12 8.04 18.7 8.87 1.75 12.49 4.87 1.11 P 值0.09 0.16 0.18 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.16 0.00 0.00 0.35

2.4 外周血Treg，淋巴細(xì)胞亞群，細(xì)胞因子與不同病因血小板減少病例組血小板相關(guān)性分析

在CTD?TP 組患者中，相關(guān)性分析結(jié)果顯示Treg 細(xì)胞比例、NK 細(xì)胞絕對值與血小板計數(shù)成正相關(guān)，血漿IL?6、IL?8、1L?17A 水平與血小板計數(shù)成負(fù)相關(guān)（P<0.05）。見表4。

表4 外周血Treg、淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子與血小板水平相關(guān)性Table 4 Platelet correlation analysis between peripheral blood Treg，Lymphocyte subsets cytokines and thrombocytopenia of different causes in the case groups

3 討論

本研究結(jié)果顯示在不同病因引起的血小板減少患者中，均存在不同程度的免疫細(xì)胞亞群紊亂和細(xì)胞因子水平異常。與對照組相比，CTD?TP 組和HD?TP 組的外周血CD3+總T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞及Treg 在CD4+T 細(xì)胞中的比例均降低，而這兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異；細(xì)胞因子比較結(jié)果顯示CTD?TP 組和ITP 組血漿IL?6、IL?8、IL?17A水平較對照組升高，而兩組的IL?8、IL?1β 和IL?17A 水平有統(tǒng)計學(xué)差異。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)在CTD?TP 組，Treg 細(xì)胞比例、NK 細(xì)胞絕對值與血小板計數(shù)成正相關(guān)，血漿IL?6、IL?8、1L?17A 水平與血小板計數(shù)成負(fù)相關(guān)。薩仁娜等［9］研究顯示，在老年免疫性血小板減少患者存在淋巴細(xì)胞減少，本研究結(jié)果顯示在ITP 組和CTD?TP 組CD4+T 淋巴細(xì)胞的數(shù)量均減少，Treg 細(xì)胞降低，這點與文獻研究一致。既往文獻報道Treg 細(xì)胞降低導(dǎo)致自身反應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞過度增生，從而產(chǎn)生抗GPⅡb/ⅢalgG血小板抗體的產(chǎn)生，導(dǎo)致免疫性血小板減少［4］。本研究中細(xì)胞因子組間比較結(jié)果顯示，IL?6，IL?8 在CTD?TP 組和ITP 組都高于對照組。Kimura 等［10］研究顯示IL?6 升高可阻止TGF?β 輔助的Treg 細(xì)胞分化作用，抑制Treg 細(xì)胞增殖，導(dǎo)致Treg 細(xì)胞降低，促進CD4+ 初始T 細(xì)胞分化為Th17，Th17分泌IL?17 促進炎癥反應(yīng)參與血小板減少發(fā)病。另外本研究在原發(fā)性免疫性血小板減少（CTD?TP組）和繼發(fā)性免疫性血小板減少（ITP 組）兩組之間比較發(fā)現(xiàn)，IL?17A 在ITP 組高于CTD?TP 組，表明在ITP 組的Th17 細(xì)胞被激活高于CTD?TP 組，ITP患者的Th17 升高分泌了更多的IL?17A 參與血小板減少發(fā)病。文獻［11］顯示ITP 患者中樹突狀細(xì)胞能夠分泌IL?6 和IL?23 以誘導(dǎo)Th17 產(chǎn)生過多，導(dǎo)致Th17/Treg 失衡，因此推斷ITP 中Th17 增多導(dǎo)致Th17/Treg 失衡的原因，而CTD?TP 組Treg 細(xì)胞減少更明顯，更傾向于是Treg 數(shù)量減少導(dǎo)致的Th17/Treg 失衡。Takahashi 等［12］研究結(jié)果顯示，在基因水平上，慢性ITP 組Treg 細(xì)胞、Th1/Th2 比值顯著高于對照組，Treg 細(xì)胞及Th1/Th2 比值與血小板計數(shù)呈負(fù)相關(guān)，而Treg 細(xì)胞的降低又是導(dǎo)致Th1/Th2 比值失調(diào)的原因之一。

通過本研究結(jié)果表明免疫相關(guān)血小板減少患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)存在Treg 細(xì)胞減少、Th17/Treg 比例失衡、淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子異常，在CTD 組Treg 細(xì)胞降低和IL?6、IL?8、1L?17A 升高與血小板計數(shù)存在正相關(guān)關(guān)系。