岳春艷 彭一 高春斌 霍占江

隨著甲狀腺癌發(fā)病的增加及相關認知的進展，關于甲狀腺癌的分子機制受關注，相關藥物開發(fā)和治療也受到重視［1］。程序性死亡受體?1（Pro?grammed death receptor?1，PD?1）與甲狀腺癌等腫瘤免疫逃逸均密切相關［2］。NOD 樣受體家族蛋白3（NOD?like receptor protein，NLRP3）激活后可將人白介素1β（interleukin 1β，IL?1β）活化而參與炎癥反應，與甲狀腺濾泡癌預后密切相關［3］。本研究分析PD?1和NLRP3的mRNA 和蛋白表達水平狀況及其對腫瘤直徑、局部侵犯、TNM 分期等臨床特征的影響，為進一步明確甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展機制及通過其PD?1 和NLRP3 相關通路干預進行甲狀腺乳頭狀癌提供參考依據(jù)。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年3月至2021年8月于張家口市第一醫(yī)院治療且病理診斷為甲狀腺乳頭狀癌患者124例為研究對象，收集患者的癌組織及配對癌旁組織標本進行研究。納入標準：①經(jīng)術后病理診斷為甲狀腺乳頭狀癌［4］；②經(jīng)手術治療，術前未經(jīng)其他外科手術處理；③檢查完善且資料全。排除標準：①合并其他癌癥或器官障礙患者、合并自身免疫性疾病患者；②前期經(jīng)放化療等抗癌治療患者。其中1 例患者因合并腎功能低下排除，納入的124 例甲狀腺乳頭狀癌患者中，男57 例，女67 例，年齡平均（41.28±10.18）歲，腫瘤直徑≥2 cm 患者53 例，腫瘤直徑<2 cm 患者71 例，有局部侵犯（顯微鏡下顯示包膜侵犯）患者55 例，無局部侵犯患者69 例，TNM 分期（美國癌癥聯(lián)合委員會第8 版甲狀腺癌TNM 分期［5］）為Ⅰ～Ⅱ期患者52 例，TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期患者72 例。研究經(jīng)本院倫理學委員會審核批準（倫理批號：2022019），且患者均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測患者癌組織和癌旁組織PD?1 和NLRP3 的信使核糖核酸（messenger rib onucleic acid，mRNA）表達水平。常規(guī)從檢測樣本中提取總RNA，逆轉錄形成cDNA，行實時熒光定量聚合酶鏈式反應，反應體系如下：cDNA 1μL，雙蒸水3.4 μL，qPCR Super?Mix 5 μL，被動參比染料（×50）0.2 μL，正向引物（10 μmol/L）0.2 μL，反向引物（10 μmol/L）0.2 μL，總體積10 μL。引物序列（上海生工生物科技有限公司合成產(chǎn)品）如下：PD?1 上游引物：5′?GC?GTGACTTCCACATGAGC?3′，PD?1 下游引物：5′?GCAGGCTCTCTTTGATCTGC? 3′。NLRP3 上 游引物：5′ ?TCACAACTCGCCCAAGGAGGAA?3′，NLRP3 下游引物：5′?AAGAGACCACGGCAGAA GCTAG? 3′。β?actin 上游引物：5′ ?TCGCTGCGC TGGTCGTC?3′，β?actin 下游引物：5′?GGCCTCGT?CACCCACATAGGA? 3′。PCR反應條件如下：95℃預變性5 min，95℃變性20 s，56℃退火5 min，72℃延伸20 s，共35個循環(huán)后，72℃延伸10 min。PD?1和NLRP3的mRNA 相對表達量采用2?ΔΔCt法計算。

1.2.2 免疫組化檢測

采用免疫組化法檢測患者癌組織和癌旁組織PD?1 和NLRP3 的蛋白表達水平。組織標本常規(guī)石蠟包埋并制成厚度為4 μm 的連續(xù)切片，切片經(jīng)烤片、脫蠟和水化后采用檸檬酸抗原修復液進行高壓抗原修復，采用3%雙氧水阻斷過氧化氫酶的活性，添加PD?1 和NLRP3 一抗（美國Proteintech 公司）在20℃處理90 min，采用鼠/兔通用二抗在20℃處理半小時，行DAB 顯色，顯微鏡下觀察顯色滿意后采用去離子水終止顯色，采用蘇木精進行復染、鹽酸乙醇進行分化，梯度酒精脫水后吹干后中性樹膠封片。由2 名病理科醫(yī)生采用雙盲法進行陽性結果判讀，光學顯微鏡下隨機選取5 個視野，200 倍放大下進行觀察，以黃色或棕黃色為染色陽性，PD?1 染色定位于細胞核，NLRP3 染色定位于細胞漿和細胞核，計算陽性細胞的百分率，陽性細胞百分率≥5%為陽性表達［2］。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件。計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗。計量資料符合正態(tài)分布并以（）表示，比較采用t檢驗。采用Logistic 回歸模型分析甲狀腺乳頭狀癌患者臨床特征影響因素。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌患者癌組織與癌旁組織中PD?1 和NLRP3 表達水平比較

甲狀腺乳頭狀癌患者癌組織中PD?1和NLRP3的mRNA 相對表達量及蛋白陽性表達率均高于其癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1、圖1。

表1 甲狀腺乳頭狀癌患者癌組織與癌旁組織中PD?1 和NLRP3 表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of PD?1 and NLRP3 expression levels in cancer tissues and adjacent tissues of patients with papillary thyroid carcinoma（±s）

表1 甲狀腺乳頭狀癌患者癌組織與癌旁組織中PD?1 和NLRP3 表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of PD?1 and NLRP3 expression levels in cancer tissues and adjacent tissues of patients with papillary thyroid carcinoma（±s）

組織癌組織癌旁組織t/χ2值P 值n 124 124 mRNA PD?1 0.91±0.16 0.13±0.03 53.356<0.001 NLRP3 1.03±0.18 0.22±0.05 48.282<0.001蛋白陽性表達率PD?1 72(58.06)15(12.10)57.525<0.001 NLRP3 87(70.16)19(15.32)76.186<0.001

2.2 不同臨床資料和臨床特征患者癌組織中PD?1和NLRP3 表達比較

不同性別、年齡患者的癌組織中PD?1和NLRP3的mRNA 相對表達量及蛋白陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。腫瘤直徑≥2 cm 患者癌組織中PD?1和NLRP3的mRNA 相對表達量及蛋白陽性表達率均高于腫瘤直徑<2 cm 患者，有局部侵犯患者癌組織中PD?1和NLRP3的mRNA 相對表達量及蛋白陽性表達率均高于無局部侵犯患者，TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期患者癌組織中PD?1和NLRP3的mRNA 相對表達量及蛋白陽性表達率均高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.05）。見表2。

表2 不同臨床資料和臨床特征患者癌組織中PD?1 和NLRP3 表達比較Table 2 Comparison of PD?1 and NLRP3 expression in cancer tissues of patients with different clinical data and clinical characteristics

2.3 甲狀腺乳頭狀癌患者癌組織中PD?1 和NLRP3表達對其臨床特征的影響

甲狀腺乳頭狀癌患者癌組織中PD?1和NLRP3的mRNA 相對表達量和蛋白陽性表達率可影響其腫瘤直徑、局部侵犯、TNM 分期等臨床特征（P<0.05）。見表3。

表3 甲狀腺乳頭狀癌患者癌組織中PD?1 和NLRP3 表達對其臨床特征的影響Table 3 Effects of PD?1 and NLRP3 expression in cancer tissues of patients with papillary thyroid carcinoma on its clinical characteristics

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌的腫瘤大小、腺外浸潤狀況、頸淋巴結轉移、遠處轉移等臨床特征有明顯的個體差異性，且預后情況差異較大［6?7］。本研究的甲狀腺乳頭狀癌患者中，有超過40%患者的腫瘤直徑≥2 cm、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期且存在局部侵犯，進一步表明甲狀腺乳頭狀癌患者臨床特征的個體差異性，而不同臨床特征患者的預后差異較大，因此，明確甲狀腺乳頭狀癌臨床特征的影響因素可能通過相關干預進行疾病預防和預后的改善。

免疫炎癥及其相關因子在甲狀腺癌中扮演重要作用［8］。PD?1為免疫相關基因，主要在T 淋巴細胞、巨噬細胞等免疫細胞中表達，以PD?L1 和PD?L2 為配體，與PD?L1 結合時可將抗原遞呈信號轉導過程進行阻斷，從而阻斷機體免疫監(jiān)視機制，為腫瘤的免疫逃逸提供有利條件，促進腫瘤的發(fā)展［9］。已有研究表明甲狀腺癌中PD?1 具有較高的蛋白表達率［2，10］。本研究中，甲狀腺乳頭狀癌患者癌組織中PD?1的mRNA 相對表達量及蛋白陽性表達率均高于其癌旁組織，進一步證實了PD?1 參與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展的可能性。本研究中不同腫瘤直徑、局部侵犯、TNM 分期患者的癌組織中PD?1 的mRNA 相對表達量及蛋白陽性表達率比較差異明顯，提示PD?1 表達與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床特征可能相關，而進一步的Logistic 回歸模型分析結果證實了甲狀腺乳頭狀癌患者癌組織中PD?1的mRNA 相對表達量和蛋白陽性表達率可影響其腫瘤直徑、局部侵犯、TNM 分期等臨床特征，PD?1 抑制劑及時干預可能有助于改善甲狀腺乳頭狀癌臨床特征狀況，間接促進預后情況的改善。

NLRP3 為最具特征性的在多種惡性腫瘤中均發(fā)揮著促癌作用的炎癥小體，可通過降低細胞毒性T 淋巴細胞的活性及比例從而腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)的殺傷作用從而促進腫瘤進展［11?12］。本研究結果顯示，甲狀腺乳頭狀癌患者癌組織NLRP3的mRNA 相對表達量及蛋白陽性表達率均高于其癌旁組織，進一步證實了NLRP3 與甲狀腺乳頭狀癌密切相關。且本研究中，不同腫瘤直徑、局部侵犯、TNM 分期患者的癌組織中NLRP3的mRNA 相對表達量及蛋白陽性表達率均差異明顯，而進一步Logistic 回歸模型分析結果證實了NLRP3 表達狀況亦與甲狀腺乳頭狀癌的臨床特征密切相關。

綜上所述，PD?1 和NLRP3 在甲狀腺乳頭狀癌組織中的mRNA 和蛋白表達水平均較高且可影響患者多種臨床臨床特征，兩者聯(lián)合干預可能輔助甲狀腺乳頭狀癌病情乃至預后改善。