蔣潔瑩 郁韶明 劉瑾

石軍顆粒原名“清開顆?！被颉扒彘_沖劑”，由大黃、石菖蒲和敗醬草三味中藥組方而成，是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院院內(nèi)制劑，能清熱解毒、豁痰開竅，主要用于治療肝炎后肝硬化引起的輕微型肝性腦病和肝性腦病?Ⅰ期及Ⅱ期［1］。方中大黃具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)的功效，為君藥；石菖蒲具有開竅豁痰，醒神益智之效，為臣藥；敗醬草能清熱解毒、利濕排膿、活血化瘀，為佐藥［2］。三藥合用起到滌蕩胃腸、清熱解毒、豁痰開竅醒神的作用。實(shí)驗(yàn)研究表明石軍顆粒具有降低血氨及內(nèi)毒素［3］、抑制肝細(xì)胞凋亡壞死［4］、改善神經(jīng)生理功能［5］、改善學(xué)習(xí)記憶能力［6］等作用，在治療肝性腦病方面臨床療效顯著［1，3］。

肝性腦?。╤epatic encephalopathy，HE）是由肝功能紊亂和/或門體分流異常引起的大腦功能失調(diào)綜合征［7］，臨床表現(xiàn)為神經(jīng)或精神異常［7?8］。中醫(yī)上屬于“神昏”、“郁證”等范疇，多是由外感、情志不暢、飲食不潔等方面導(dǎo)致的肝疏泄功能失常所致［1，5］。本研究運(yùn)用公共數(shù)據(jù)平臺(tái)及生物信息學(xué)分析方式，從整體和分子層面探討石軍顆粒治療肝性腦病的作用機(jī)制及靶點(diǎn)，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP，https：//tcmspw.com/index.php）；DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https：//go.drugbank.com/）；GEO數(shù)據(jù)庫（GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）；DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）；Omicshare（http：//www.Omicshare.com/）；Cytoscape 3.7.1 軟件；四氯化碳（CCl4）購于宜興市洋溪徐瀆化工廠。

1.2 石軍顆?；瘜W(xué)成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

運(yùn)用TCMSP 平臺(tái)，以“大黃”、“石菖蒲”、“敗醬草”為關(guān)鍵詞查找化學(xué)成分，同時(shí)限定參數(shù)OB≥30%和DL≥0.18 進(jìn)行篩選［9］，并選取來源于Drug?Bank 的成分靶點(diǎn)。

1.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)收集

以“hepatic encephalopathy”為關(guān)鍵詞，在GEO數(shù)據(jù)庫中檢索，選取GSE57193 芯片，設(shè)定adjusted p?value<0.05 和|log 2（fold change）|>1 篩選得到的差異基因即為肝性腦病的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將篩選得到的石軍顆?；瘜W(xué)成分和靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建石軍顆粒成分?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)（node）代表成分和靶點(diǎn)，邊（edge）代表成分和靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。將石軍顆粒成分靶點(diǎn)和肝性腦病相關(guān)差異基因數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件，利用Bisogenet 插件構(gòu)建石軍顆粒和肝性腦病蛋白?蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行融合，通過設(shè)置Degree、Closeness、Betweenness、Network、Eigenvector、Local Average Connectivity?based method（LAC）等參數(shù)篩選石軍顆粒治療肝性腦病的靶點(diǎn)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)融合

將石軍顆粒PPI 網(wǎng)絡(luò)和肝性腦病PPI 網(wǎng)絡(luò)Merge 后，選其交集進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建。依據(jù)文獻(xiàn)方法［10］，以degree centrality >68 篩選。然后進(jìn)行拓?fù)浞治觯玫绞婎w粒治療肝性腦病的靶點(diǎn)。

1.6 石軍顆粒治療肝性腦病靶點(diǎn)的富集分析

將篩選得到的候選靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行Pathway 分析，并設(shè)置FDR<0.01 作為篩選條件。利用omicshare 繪制KEGG 通路結(jié)果氣泡圖。

1.7 動(dòng)物飼養(yǎng)、造模及給藥

體重250～300 g 的雌性和雄性SD 大鼠，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供及飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫20℃，14 h 照明和10 h 黑暗。除正常組外，實(shí)驗(yàn)大鼠都按0.5 mL/kg 腹腔注射CCl4，三天后按相同劑量腹腔注射30%CCl4石蠟油混合液，接下來每周注射3 次，連續(xù)3 周，造模周期一共為4 周。給藥組在造模完成后開始給藥，每日1 次灌胃給藥，連續(xù)給藥2 周。對(duì)照組給予乳果糖，正常組給予同等體積生理鹽水。

1.8 Western blot

PC12 細(xì)胞用含10%胎牛血清、5%馬血清和1%青霉素?鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃含95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)箱中。按2×106cells/孔的濃度將PC12 細(xì)胞接種于10 cm 規(guī)格的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h。用濃度為200 μg/mL 的石軍顆粒80%甲醇提取物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理0.5 h，然后用4 mM 的MPP+處理24 h。用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，加入1%的蛋白酶抑制劑和1%的磷酸酶抑制劑。用BCA 法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，按蛋白定量試劑盒說明書操作。以每個(gè)點(diǎn)樣孔40 μg 蛋白的量進(jìn)行上樣，并加入7 μL 的蛋白marker，然后進(jìn)行跑膠，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯轉(zhuǎn)移膜上。接下來在5%的脫脂牛奶進(jìn)行封閉2 h，然后在4℃環(huán)境下用β?actin（45 kDa）、Akt（60 kDa）、p?Akt（60 kDa）、JNK（46、54 kDa）、p?JNK（46、54 kDa）抗體進(jìn)行過夜孵育，隨后用非特異性二抗孵育1 h。使用eECL 曝光試劑盒對(duì)膜進(jìn)行曝光，最后使用熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)測(cè)定各個(gè)蛋白的表達(dá)。

1.9 血氨和肝功能檢測(cè)

腹主動(dòng)脈取血并分離血清，用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate Transaminase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（gamma?glutamyltransferase，GGT）、白蛋白（Albumin，ALB）和球蛋白（globulin，G）含量，用血氨檢測(cè)儀檢測(cè)血氨濃度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；正態(tài)分布、方差齊性的計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 石軍顆?；瘜W(xué)成分及靶點(diǎn)收集

去除無靶點(diǎn)和重復(fù)的化合物后，共篩選得到20 個(gè)石軍顆粒成分，見表1。共獲得99 個(gè)靶點(diǎn)。

表1 石軍顆?；瘜W(xué)成分信息Table 1 The chemical compositions of Shijun Granules

2.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)

共得到肝性腦病相關(guān)靶點(diǎn)305 個(gè)。

2.3 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

20個(gè)化學(xué)成分的degree中位數(shù)是8.5。其中degree較高的成分為quercetin、kaempferol、stigmasterol、lute?olin、beta?sitosterol；靶點(diǎn)包括PTGS2、NCOA2、PTGS1、AR、PRSS1。石軍顆粒成分?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見圖1。

圖1 石軍顆粒成分?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 The composition?target network of Shijun Granules

2.4 網(wǎng)絡(luò)融合

石軍顆粒PPI 網(wǎng)絡(luò)和肝性腦病PPI 網(wǎng)絡(luò)Merge后的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2A。以degree centrality>68 篩選后的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2B。經(jīng)拓?fù)浞治龊?，得到石軍顆粒治療肝性腦病的207 個(gè)靶點(diǎn)，見圖2C。

圖2 石軍顆粒治療肝性腦病的候選作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Identification of candidate targets of Shijun Granules against HE

2.5 KEGG 富集分析

KEGG 分析結(jié)果中包含16 條疾病通路和4 條信號(hào)通路，主要是Viral carcinogenesis、Alcoholism、Cell cycle 和MAPK signaling pathway 等，見 圖3。建立石軍顆粒治療肝性腦病靶點(diǎn)?通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。MAPK1、AKT1、NFKB1、RELA、TP53、GRB2、EGFR 等節(jié)點(diǎn)也具有較大的degree 值，構(gòu)建石軍顆粒治療肝性腦病關(guān)鍵靶點(diǎn)?成分網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5。

圖3 石軍顆粒治療肝性腦病預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的KEGG 分析Figire 3 The KEGG analysis of Shijun Granules against HE

圖4 石軍顆粒治療肝性腦病靶點(diǎn)?通路網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 The target?pathway network of Shijun Granules against HE

圖5 石軍顆粒治療肝性腦病關(guān)鍵靶點(diǎn)?成分網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 The key target?composition network of Shijun Granules against HE

2.6 石軍顆粒調(diào)控MAPK 和PI3K?Akt 信號(hào)通路

MPP+刺激的細(xì)胞p?JNK 蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較顯著升高，而對(duì)JNK 蛋白的表達(dá)無明顯影響，當(dāng)細(xì)胞用石軍顆粒提取物預(yù)處理后，細(xì)胞p?JNK 蛋白表達(dá)與MPP+組比較明顯降低，MPP+刺激的細(xì)胞p?AKT 蛋白表達(dá)顯著降低，而當(dāng)細(xì)胞用石軍顆粒提取物預(yù)處理后，細(xì)胞p?AKT 蛋白表達(dá)明顯升高。見圖6。

圖6 石軍顆粒對(duì)MPP+誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effect of Shijun granules on protein expression of MPP+induced damaged PC12 cells

2.7 石軍顆粒對(duì)HE 大鼠血氨濃度和血清ALT、AST、ALP、GGT、ALB、G 含量的影響

與正常組相比，模型組動(dòng)脈血氨濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)給予乳果糖和石軍顆粒后，血氨濃度顯著下降，其中給藥組具有更低的血氨水平。與正常組相比，模型組ALT、AST、ALP、GGT 和G 含量升高，當(dāng)給予乳果糖后ALT、AST、ALP 和GGT 含量下降，但G 含量與模型組相比并沒有顯著降低。當(dāng)模型大鼠給予石軍顆粒后，ALT、AST、ALP、GGT 以及G 含量與模型組相比都顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中G 含量降低到正常水平。見表2。

表2 血氨濃度和ALT、AST、ALP、GGT、ALB、G 含量比較Table 2 Comparison of blood ammonia concentration and ALT，AST，ALP，GGT，A，G content

3 討論

國內(nèi)外文獻(xiàn)顯示肝硬化患者出現(xiàn)輕微肝性腦病的比率為39.9%至75%，而患輕微肝性腦病的患者病情會(huì)進(jìn)展為肝性腦病［11］。肝性腦病是肝硬化常見并發(fā)癥，也是導(dǎo)致肝病死亡的常見原因。肝性腦病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全確定其發(fā)病機(jī)制，常見的機(jī)制有氨中毒、炎癥損傷、神經(jīng)遞質(zhì)功能損傷、錳中毒、膽汁酸升高、氧化/亞硝化應(yīng)激、腸道微生物失衡、氨基酸失衡、低鈉血癥、鋅缺乏、腦能量代謝失衡、腦干網(wǎng)狀系統(tǒng)損傷等［11?14］。因此肝性腦病相關(guān)的治療策略主要是從祛除誘因著手，如：降氨、抗感染、飲食調(diào)節(jié)、肝移植等［15］。中醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為肝性腦病的病機(jī)是熱、毒、痰、瘀互結(jié)，導(dǎo)致腑氣不通，腦竅蒙蔽，治療應(yīng)以清熱解毒、涼血化瘀為主。

石軍顆粒由大黃、石菖蒲和敗醬草組方而成，在治療肝性腦病方面具有較好的臨床療效。自2000年在臨床應(yīng)用以來，前后進(jìn)行了多次臨床研究，探討了石軍顆粒經(jīng)口服或灌腸給藥后在治療輕微肝性腦病、肝性腦病、肝硬化合并肝性腦病、代償期肝硬化輕微肝性腦病、慢性肝病后肝硬化并發(fā)輕微型肝性腦病等疾病方面的臨床療效，但其治療肝性腦病的作用機(jī)制仍未明確。本研究應(yīng)用公共數(shù)據(jù)平臺(tái)及生物信息學(xué)分析方法，基于分子層面和整體角度探究石軍顆粒治療肝性腦病的作用機(jī)制，將成分和疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，運(yùn)用多靶點(diǎn)，多成分的研究模式，對(duì)化合物對(duì)疾病的作用機(jī)制及藥理作用進(jìn)行分析。研究結(jié)果顯示石軍顆?？赡苁峭ㄟ^調(diào)控MAPK、PI3K?Akt、ErbB、HIF?1等信號(hào)通路發(fā)揮作用；MAPK1是石軍顆粒治療肝性腦病的核心靶點(diǎn)，AKT1、NFKB1、RELA、TP53、GRB2、EGFR等為關(guān)鍵靶點(diǎn)；石軍顆粒通過調(diào)控MAPK1、AKT1、NFKB1等基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄以及通過對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)的作用，調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究對(duì)于探究石軍顆粒治療肝性腦病的作用機(jī)制、重要靶點(diǎn)以及活性成分等有一定幫助。但是由于數(shù)據(jù)庫涵蓋信息的局限、篩選條件的限定以及成分和靶點(diǎn)的復(fù)雜性，使得研究結(jié)果具有一定的片面性。本研究通過分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，明確了MAPK 和PI3K?Akt 信號(hào)通路是石軍顆粒發(fā)揮作用的機(jī)制。同時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，石軍顆?？捎行Ц纳艸E 大鼠肝功能，降低動(dòng)脈血氨濃度。因此，推斷石軍顆?？赡芡ㄟ^調(diào)控MAPK 和PI3K?Akt 信號(hào)通路改善肝性腦病患者的肝功能，降低由氨誘導(dǎo)的腦細(xì)胞腫脹和氧化應(yīng)激，發(fā)揮治療肝性腦病的作用。