李健 胡志強 杜忠偉 王旭 所玉紅 王鑫

(延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學院/國家食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系延吉綜合試驗站，吉林 延吉 133000)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(L.)Link)屬于子囊菌門(Ascomycota)糞殼菌綱(Sordariomycetes)肉座菌亞綱(Hypocreomycetidae)肉座菌目(Hypocreales)蟲草菌科(Cordycipitaceae)蟲草屬(Cordyceps)，又名北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草菌等，簡稱蛹草[1]。野生蛹蟲草地理分布遍及全世界，在我國四川、云南、西藏、黑龍江、遼寧、吉林、安徽、廣東、廣西、陜西、河北、湖南、甘肅、湖北、臺灣等地均有分布；在國外北美洲、南美洲、歐洲和亞洲等地均有分布[2]。野生蛹蟲草主要寄生在林地枯枝落葉中鱗翅目幼蟲的繭和蛹上，以及鞘翅目和雙翅目等昆蟲的蛹、成蟲或幼蟲上[3,4]。目前，國內(nèi)外蛹蟲草研究方向上的熱點為其應用上的研究[5]。

蟲草素又稱蟲草菌素或3′-脫氧腺苷(Cordycepin或3′-Deoxyadenosine)，具有抑菌、抗病毒等生物活性，表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、擴張支氣管、增強睡眠、顯著增強腎上腺素等藥理作用功能[6]。天然蟲草素主要來源于蛹蟲草，蛹蟲草中蟲草素含量是冬蟲夏草的數(shù)10倍[7,8]，且人工栽培技術(shù)成熟，已逐漸成為冬蟲夏草的理想替代品[9]。蟲草素價格非常昂貴，目前能以腺苷、3′-O-對硝基苯磺?；佘盏葹樵线M行化學合成[10]。由于蟲草素的重要藥用價值，目前許多研究通過優(yōu)化培養(yǎng)基，誘導突變菌種選育使蛹蟲草的蟲草素產(chǎn)量不斷提高[11,12]。雖然通過誘導突變選育出高產(chǎn)蟲草素的菌株，但是存在未知的生物安全因素，本文所用蛹蟲草為野生采集篩選出來的高產(chǎn)蟲草素菌株，安全穩(wěn)定不易退化。

隨著人們對蟲草了解的增加，國內(nèi)外市場的需求也隨之增加。由于自然資源的限制，濫采蟲草導致市場上的蟲草短缺。作為冬蟲夏草的替代品，蛹蟲草人工栽培已經(jīng)成熟，但新藥研究和保健品開發(fā)方面還需深入研究。蛹蟲草在抗腫瘤和病毒抑制方面都優(yōu)于冬蟲夏草，因此對其進行研發(fā)具有直接的現(xiàn)實意義和較高的經(jīng)濟價值。然而，目前對蠶蛹蟲草的活性成分、藥理作用和作用機制的研究還很有限。隨著研究技術(shù)和方法的不斷發(fā)展，相信蛹蟲草會更好、更充分地為人類服務，為人類作出新的貢獻。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(L.)Link)菌株由延邊叁壹叁生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所提供。

1.2 主要試劑和儀器

葡萄糖、瓊脂、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、75%酒精等均為國產(chǎn)分析純。上海博迅YXQ-100A立式壓力蒸汽滅菌器，太倉華美THZ-C臺式恒溫震蕩培養(yǎng)箱，天津泰斯特DZ-10LⅢ蒸餾水器,上海雷磁JB-3A磁力攪拌器，上海雷磁PHS-3C pH計，蘇州安泰SW-CJ-1BU潔凈工作臺，上海精宏DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅BIC-400人工氣候箱，上海博迅GZX-9240MBE電熱鼓風干燥箱，常熟雙杰JJ223BC分析天平，青島海爾HYC-390F冷藏冷凍箱。

1.3 PDA培養(yǎng)基

先將馬鈴薯洗干凈削去外皮，再稱取馬鈴薯200g切成條，在鍋中加水1000mL，再加入稱量好的馬鈴薯條，煮沸30min，直至馬鈴薯條被煮爛即可，用多層紗布過濾后濾渣棄去，留取濾液在鍋中，再加入瓊脂粉20g，待瓊脂溶解完后，加入葡萄糖20g，繼續(xù)加熱攪拌均勻，再補水分至1000mL，分裝在玻璃試管中大概1/3位置，塞上棉塞，高溫高壓121℃滅菌30min后取出試管擺放斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆?，pH值自然。

1.4 液體培養(yǎng)基

先將馬鈴薯洗干凈削去外皮，再稱取馬鈴薯200g切成條，在鍋中加水1000mL，再加入稱量好的馬鈴薯條，煮沸30min，直至馬鈴薯條被煮爛即可，用多層紗布過濾后濾渣棄去，留取濾液在鍋中，再加入葡萄糖20g、硫酸鎂1.0g、磷酸二氫鉀1.0g，繼續(xù)加熱攪拌均勻，再補水分至1000mL，分裝在三角瓶中大概1/2位置，塞上棉塞，高溫高壓121℃滅菌30min后取出，冷卻后貯存?zhèn)溆?，pH值自然。

1.5 栽培培養(yǎng)基

1.5.1 配方1

在栽培瓶中加入糙米50g、蠶蛹50g、水30mL，蓋好瓶蓋。

1.5.2 配方2

在栽培瓶中加入糙米50g、水70mL，蓋好瓶蓋。

1.5.3 配方3

在栽培瓶中加入蠶蛹50g，蓋好瓶蓋。

上述3種培養(yǎng)基配制完成后，高溫高壓121℃滅菌30min后取出，冷卻后貯存?zhèn)溆?，pH值自然。

1.6 栽培方法

1.6.1 制備母種

提前將制備好的PDA培養(yǎng)基放在潔凈工作臺上，用紫外線燈消毒滅菌30min，在酒精燈火焰上方將活化的蛹蟲草保留菌種用接種鉤取綠豆粒大小移植試管斜面培養(yǎng)基的適當位置，迅速塞上棉塞。將接種好的試管在恒溫培養(yǎng)箱中26℃避光培養(yǎng)10d，注意通風并檢查菌絲生長情況。

1.6.2 制備液體菌種

提前將制備好的液體培養(yǎng)基放在潔凈工作臺上，用紫外線燈消毒滅菌30min，在酒精燈火焰上方將活化的蛹蟲草母種用接種鉤取綠豆粒大小移植到液體培養(yǎng)基中，迅速塞上棉塞。將接種好的液體培養(yǎng)基在立式智能精密搖床中26℃靜止培養(yǎng)24h，之后進行懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為110r·min-1，在26℃的條件下避光培養(yǎng)6d，得到液體菌種，將液體菌種用磁力攪拌器打碎后即可用于接種。

1.6.3 制備栽培種

分別制作3種配方培養(yǎng)基各100瓶，高溫高壓121℃滅菌30min，滅菌結(jié)束后將栽培種放在潔凈工作臺上，用紫外線燈消毒滅菌30min，待培養(yǎng)基冷卻后在酒精燈火焰上方接入20mL液體菌種，迅速蓋好瓶蓋。

1.6.4 出菇管理

將接種好的栽培瓶置于人工氣候箱中，在溫度22℃、濕度55%～60%條件下避光培養(yǎng)，期間注意檢查雜菌情況，按時通風，避免二氧化碳濃度過高。待菌絲體長滿整個培養(yǎng)基表面和吃透整個培養(yǎng)基時注意觀察培養(yǎng)基表面小隆起形成時間，若培養(yǎng)基表面有小隆起時每天12h需給予400Lux左右的散射光照射，促進轉(zhuǎn)色。在溫度22℃、濕度75%條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直至小隆起生長成橘黃色的原基。在原基形成后溫度20℃、濕度80%以上、每天12h需給予400～800Lux左右的散射光照射條件下，按時通風，促進原基分化，子座形成后同條件培養(yǎng)，直至子實體成熟。

1.7 采摘送檢

當子座長到5～8cm，表面有橘黃色粉狀物出現(xiàn)時，即表示蟲草成熟可采收。采收時，用竹鑷子從栽培瓶內(nèi)取出蟲草，并稱取每瓶子實體鮮重，然后在電熱鼓風干燥箱中45℃條件下烘干至恒重，稱取每瓶子實體干重，并取樣品200g送至上海微譜化工技術(shù)服務有限公司檢測蟲草素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草栽培記錄

通過對3種配方培養(yǎng)基栽培蛹蟲草各個階段記錄，見表1，可以看出3種配方培養(yǎng)基在菌絲萌發(fā)和菌絲覆蓋培養(yǎng)基時的時間差距不大，但在后續(xù)生長時間差距較大，配方2與配方3在形成原基時相差10d，形成子實體時相差21d，子實體成熟時相差19d，這可能由于配方3采用純蠶蛹作為培養(yǎng)基，蛹蟲草菌絲不易吃透蠶蛹培養(yǎng)基，導致蛹蟲草生長發(fā)育緩慢。配方2比配方1和配方3菌絲發(fā)育更早、形成原基和子實體更早、成熟更早，這可能由于配方2采用純糙米作為培養(yǎng)基，蛹蟲草菌絲容易吃透蠶蛹培養(yǎng)基，導致蛹蟲草生長發(fā)育較快。

表1 蛹蟲草栽培記錄

從圖1可以看出，3種配方培養(yǎng)基蛹蟲草子座比市面售賣的蛹蟲草子座更加扁寬，而且比較稀疏，這可能與此蛹蟲草菌株自身特點有關(guān)。由于本試驗栽培蛹蟲草只采收1茬，所以采收較晚，蛹蟲草子實體生長已經(jīng)彎曲不直，可能與采收較晚或人工氣候箱光源角度固定有關(guān)。3種配方培養(yǎng)基蛹蟲草子實體均生長茂密粗壯，顏色呈橘黃色，長勢良好，已經(jīng)成熟可以進行采摘。

圖1 成熟蛹蟲草子實體

2.2 蛹蟲草測產(chǎn)

對3種配方培養(yǎng)基栽培蛹蟲草采摘測產(chǎn)取平均值，從表2可以看出，蛹蟲草栽培配方1平均干重9.28g，平均鮮重56.76g，干濕比為16%，生物學轉(zhuǎn)化率達到56.76%；配方2平均干重8.38g，平均鮮重53.46g，干濕比為16%，生物學轉(zhuǎn)化率達到106.92%；配方3平均干重8.26g，平均鮮重51.24g，干濕比為16%，生物學轉(zhuǎn)化率達到102.48%。

表2 蛹蟲草平均產(chǎn)量及生物學轉(zhuǎn)化率

2.3 蟲草素含量檢測

根據(jù)檢測結(jié)果可知，配方1培養(yǎng)基栽培蛹蟲草蟲草素含量為15.63mg·g-1，配方2培養(yǎng)基栽培蛹蟲草蟲草素含量為21.67mg·g-1，配方3培養(yǎng)基栽培蛹蟲草蟲草素含量為13.76mg·g-1，臺灣桃園蟲草蟲草素含量為0.34mg·g-1。配方1和配方2培養(yǎng)基栽培蛹蟲草蟲草素含量相差最大為6.04mg·g-1，3種配方培養(yǎng)基栽培蛹蟲草蟲草素含量區(qū)別不大。配方2培養(yǎng)基栽培蛹蟲草蟲草素含量與對照組臺灣桃園蟲草蟲草素含量相差最大為21.33mg·g-1，大約是對照組臺灣桃園蟲草蟲草素含量的64倍。

表3 蟲草素含量檢測結(jié)果

3 討論

本試驗利用3種配方培養(yǎng)基對蛹蟲草進行栽培比較試驗，結(jié)果3種配方培養(yǎng)基栽培的蛹蟲草質(zhì)量無明顯區(qū)別，但糙米培養(yǎng)基生物學轉(zhuǎn)化率更高，栽培的蛹蟲草菌絲發(fā)育更早、形成原基和子實體更早、成熟更早，且糙米加水培養(yǎng)基所栽培蛹蟲草蟲草素含量最高，是對照組臺灣桃園蟲草蟲草素含量的64倍，在實際生產(chǎn)中使用糙米加水培養(yǎng)基可降低成本，可作為今后商品化、工廠化栽培生產(chǎn)蛹蟲草提取蟲草素的首選培養(yǎng)基大力推廣應用。

本試驗采收蛹蟲草子實體較晚，且只采收1茬，生長出的蛹蟲草子實體子座比市面售賣的蛹蟲草子座更加扁寬，而且比較稀疏，這可能與此蛹蟲草菌株自身特點有關(guān)。本試驗雖然將此蛹蟲草菌株成功栽培，且蟲草素含量較高，但此蛹蟲草菌株還是易退化，這與宋金俤等[13]的研究相一致，保持菌種活力還需要進一步的研究。張紅等[14]采用60Co-γ射線輻射誘變蛹蟲草菌株蟲草素含量達9.6mg·g-1，李文等[15]采用低能離子束注入蛹蟲草，篩選突變菌株蟲草素含量11.92mg·g-1，溫魯?shù)萚16]研究航天搭載蛹蟲草的蟲草素含量16.40mg·g-1，本試驗測得糙米加水培養(yǎng)基栽培蛹蟲草蟲草素含量為21.67mg·g-1，都明顯高于其他物理化學等誘變方式，提高蛹蟲草蟲草素含量。因此，具有較大研究價值，仍有待于進一步研究。