葉柏柏，林城，王心寧，常征輝，李林福

1.贛南醫(yī)學院，江西 贛州 341000； 2.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)屬于膝關節(jié)退行性病變，故又稱退行性關節(jié)炎，通常表現(xiàn)為骨關節(jié)軟骨變形、破壞及增生等特點，因其患病人數(shù)和患病率都位列世界排行首位，被世界衛(wèi)生組織定義為“第一致殘疾病”，致殘率高達53%[1]。據(jù)報道，OA已經(jīng)給患者帶來了嚴重的經(jīng)濟負擔，目前，我國OA患病率高達5.1%以上，而英國、美國成年人患病率就已高達5%～10%[2]。迄今為止，國內外依舊缺乏有效且經(jīng)濟的治療方法來治愈OA。

氧化苦參堿(oxymatrine，OM)是苦參堿類生物堿，大量研究表明，其有多種生理藥性，如抗心律失常、抗感染、抗腫瘤、調節(jié)免疫、保護肝臟、抗病毒、抗氧化等[3-9]。OM有良好的藥代動力學(ADME)特性，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢到OM的OB(Oral Bioavailability)值為0.35，DL(Drug Like)值為0.28，而且OM的堿極性適中，易溶于水和醇類溶劑，方便藥物制劑。此外，OM在很多藥用植物中存在，具有來源廣泛的特性，尤其是苦參、苦豆子、白刺花等豆科植物中含量高達1%以上?；谏鲜龀伤幮院谩⒔?jīng)濟易得的優(yōu)勢，使其具備良好的藥物開發(fā)前景。

有報道表明，OM治療OA具有顯著作用[10-11]。相對于其他常見的藥理活性，OM在治療OA方面的研究不多，尤其是機制方面不夠明確。網(wǎng)絡藥理學是一種高效的生物信息學工具，可用于預測活性成分治療疾病的候選靶點和潛在機制[12-13]。本課題組參照文獻[14]中采用的網(wǎng)絡藥理學方法，對OM治療OA的作用機制進行系統(tǒng)的預測，并輔以分子對接驗證，為后續(xù)的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和軟件本研究所涉及的一些數(shù)據(jù)庫及軟件匯總，見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫和軟件匯總

1.2 獲取化合物目標靶點在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以“oxymatrine”為化合物名稱項檢索詞來獲取OM的目標靶點。同時，在ZINC數(shù)據(jù)庫檢索中以“oxymatrine”為化合物名稱項檢索詞以獲取OM的mol2格式，再將OM的mol2格式分子結構上傳到Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫平臺，靶點類型選擇“Human Protein Targets Only”，設定靶點數(shù)為300，完成在該平臺OM目標靶點的預測。最后將兩個數(shù)據(jù)庫獲取的目標靶點合并去重，得到OM的目標靶點。

1.3 獲取OA潛在作用靶點以“osteoarthritis”為疾病項檢索詞，在OMIM和Gene Cards數(shù)據(jù)庫中檢索OA相關基因，合并從這兩個數(shù)據(jù)庫中獲取的基因，去重，將其相關基因編碼的蛋白作為藥物治療OA的潛在作用靶點。

1.4 OM和OA的交集靶點應用Draw Venn Diagram在線服務平臺將OM(drug)的目標靶點和OA(disease)的潛在作用靶點進行交集，將兩者交集出的靶點作為OM治療OA的潛在作用靶點。

1.5 構建蛋白互作網(wǎng)絡及篩選核心靶點于在線數(shù)據(jù)庫STRING 10.0 (http：//string-db.org) 中將獲取的交集基因上傳至“Multiple Proteins”項，在“Organism”項下選擇“Homo sapiens”“minimum required interaction score”選擇>0.70，在線生成PPI 網(wǎng)絡，計算度值最前的20個核心基因，并繪制其柱狀圖。

1.6 基因本體(gene ontology，GO)與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析在Dvid V 6.7在線平臺(https：//david-d.ncifcrf.gov/home.jsp) 對交集所得到的基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。將閾值設定為P值<0.05后，取排在前20的GO term和KEGG通路，再用R包繪制氣泡圖進行分析。

1.7 構建交集基因-GO-KEGG網(wǎng)絡應用Cytoscape 3.7.1軟件 (http：//www.Cytoscape.org/) 構建交集基因-GO-KEGG網(wǎng)絡，將前面已獲取的交集靶點、GO富集分析結果和KEGG富集分析結果導入軟件，通過網(wǎng)絡節(jié)點度值(degree)的大小對網(wǎng)絡進行分析以探究苦參堿治療OA的作用機制。

1.8 分子對接驗證先以“oxymatrine”為關鍵詞在PubChem數(shù)據(jù)庫檢索下載其2D結構的SDF文件，再從RCSB PDB下載篩選出來的核心靶點蛋白質結構的PDB文件，運行Discovery studio 2019軟件將化合物小分子與核心靶點蛋白大分子對接驗證。

2 結果

2.1 OM治療OA的潛在靶點基于數(shù)據(jù)庫平臺Pharm Mapper及TCMSP在線檢索得到的化合物靶點經(jīng)合并去重后，共得到155個OM目標靶點；基于數(shù)據(jù)庫平臺OMIM和Gene cards在線檢索得到的疾病相關基因經(jīng)合并去重后，共得到3 114個OA相關基因。兩者經(jīng)過韋恩圖交集，共得到80個OM治療OA的潛在靶點，見圖1。

圖1 交集后得到的OM治療OA的潛在靶點

2.2 構建蛋白互作網(wǎng)絡及篩選核心靶點將OM和OA的交集靶點導入STRING在線網(wǎng)絡平臺中，再選擇互作評分>0.70，得出PPI網(wǎng)絡圖，將離散點隱藏，統(tǒng)計得到244條邊和72個節(jié)點。按照度(degree)值排序篩選出最高的前30個蛋白質節(jié)點。核心節(jié)點是指某蛋白質擁有的邊數(shù)為所有蛋白質平均邊數(shù)兩倍以上的節(jié)點，即擁有的邊數(shù)>13.56。由圖2B可知，前30個蛋白質均>26，都為核心節(jié)點。其中，排名前5位的依此為：AKT1(26)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)(26)、SRC(23)、MYC(19)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)(18)，見圖2。

注：A：交集基因的PPI網(wǎng)絡圖；B：前30個核心交集基因柱狀圖圖2 交集基因PPI網(wǎng)絡圖和前30個核心交集基因柱狀圖

2.3 GO term富集分析采用DAVID在線服務平臺對OM治療OA涉及的80個蛋白質的GO term進行富集分析。對分析所得的結果進行篩選，設定 p.adjust<0.05以及FDR<0.05，涉及到分子功能的條目共有119個，再按照P值列出前20個較為顯著的條目，見圖3。由圖3可知，OM治療OA時涉及的基因功能主要有：endopeptidase activity(內肽酶活性)、DNA-binding transcription factor binding(DNA結合轉錄因子結合)、DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase II-specific(DNA結合轉錄激活因子活性，RNA 聚合酶 II 特異性)、DNA-binding transcription activator activity(DNA結合轉錄激活劑活性)、nuclear receptor activity(核受體活性)。

圖3 交集基因GO term富集的前20個條目

2.4 KEGG通路分析采用DAVID在線服務平臺對OM治療OA涉及的80個蛋白質的KEGG通路進行富集分析。對分析所得結果進行篩選，設定p.adjust<0.05以及FDR<0.05，涉及到治療OA的信號通路共有129個，再按照P值列出前20個較為顯著的條目，見圖4。由圖4可知，OM用于治療OA時涉及的信號通路主要有：proteoglycans in cancer (癌癥蛋白聚糖)、PI3K-Akt signaling pathway(磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶 B 信號通路)、Lipid and atherosclerosis(血脂和動脈粥樣硬化)、MAPK signaling pathway(MAPK信號通路)、Chemical carcinogenesis receptor activation(化學致癌受體激活)、Prostate cancer(前列腺癌)。

圖4 交集基因KEGG通路富集的前20個條目

2.5 交集基因-GO-KEGG網(wǎng)絡分析如圖5所示，在交集基因-GO-KEGG網(wǎng)絡圖中，涉及到OM治療OA的交集基因有63個節(jié)點、GO term有10個節(jié)點和KEGG信號通路有10個節(jié)點。其中，長方形為交集基因，三角形為GO term，V形為KEGG信號通路，每兩個節(jié)點之間有連接就說明他們之間有潛在的聯(lián)系，GO term-交集基因邊106條以及KEGG信號通路-交集基因邊143條，這說明OM治療OA時，可能涉及多個靶點，有多種生物效應共同參與，并存在多種作用機制。按度值大小排序，前五的交集基因依次為：RELA(13)、AKT1(12)、ESR1(9)、GRB2(9)、PPARA(9)。

2.6 分子對接結果將從PubChem數(shù)據(jù)庫檢索下載得到的OM三維結構(SDF格式)與篩選出前5個核心靶點進行分子對接驗證。小分子與靶點的對接結果為：Libdockscore>100時，表明兩者能夠自由、穩(wěn)定對接。如表2所示，OM與各靶點對接得到的Libdockscore均>92，表明OM和核心靶點能夠相對穩(wěn)定地對接，見表3。由圖6可知，OM主要是通過傳統(tǒng)氫鍵、碳氫鍵、P-Pi共軛、堿基孤對電子與靶點結合。

注：長方形為交集基因，三角形為GO term，V形為KEGG信號通路圖5 交集基因-GO-KEGG網(wǎng)絡圖

表2 分子對接結果

圖6 Oxymatrine與核心靶點對接示意圖

表3 基因表達蛋白及蛋白RCSB號

3 討論

OA是由于關節(jié)退行性功能失調引起的慢性疾病，病因包括老年化、肥胖、運動損傷、炎癥及遺傳易感性等[15]，該病程所涉及的生物效應數(shù)不勝數(shù)，分子機制更是復雜，已經(jīng)報道證實的就有PERK/Bip信號通路、p38MAPK信號通路、Wnt/β-catenin 信號通路、NF-κB信號通路、TLR/MyD88信號通路、TGF-β /BMPs信號通路、細胞骨架信號通路，以及某些與他們存在cross-talk的信號通路等[16-20]。使用不同的活性成分治療OA，其治療過程中涉及的靶點、機制各有不同[21-23]。在本研究中，共交集得到80個OM治療OA的目標靶點，獲取AKT1、IL-6、SRC、MYC和TNF等核心靶點，富集到119個GO條目和129條KEGG通路。GO條目和KEGG通路中，涉及最多的基因依次為：RELA、AKT1、ESR1、GRB2、PPARA。

本研究經(jīng)PPI網(wǎng)絡分析得到AKT1、IL-6、SRC、MYC和TNF等核心靶點，表明OM治療OA時，上述蛋白質參與的概率最高，被旁路激活的可能性最大。而如上述的GO條目和KEGG通路中涉及最多的基因為：RELA、AKT1、ESR1、GRB2、PPARA。這表明，在優(yōu)選的GO條目和KEGG通路中，RELA、AKT1、ESR1、GRB2、PPARA的共有率最高。將兩種情況進行比較分析，發(fā)現(xiàn)均存有AKT1，表明其代表性較強，具有一定的研究意義，后續(xù)值得關注。

GO條目中，P值較為顯著的前5個依次為：endopeptidase activity(內肽酶活性)、DNA-binding transcription factor binding(DNA結合轉錄因子結合)、DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase II-specific (DNA 結合轉錄激活因子活性，RNA 聚合酶 II 特異性)、DNA-binding transcription activator activity(DNA結合轉錄激活劑活性)、nuclear receptor activity(核受體活性)，他們與OA的發(fā)病有著密切聯(lián)系。內肽酶活性可催化多肽鏈中內部α-肽鍵的水解，如MMP-3作為具有細胞外活性的鋅依賴性內肽酶，在OA的產(chǎn)生過程中起著重要作用[24]。DNA結合轉錄因子結合則是通過與基因調控區(qū)內特定的DNA序列相互作用來調節(jié)轉錄。DNA 結合轉錄激活因子活性是指RNA 聚合酶II特異性激活或增加由RNA聚合酶II轉錄的特定基因集的轉錄。DNA結合轉錄激活劑活性可以通過激活或增加特定基因組轉錄來影響DNA結合轉錄因子活性。核受體活性是一種可以通過與DNA結合的方式來抑制或者減少特定基因組轉錄的輔助抑制活性。上述的后4個GO條目在細胞內遺傳信息流通是極為常見的，OA的發(fā)生過程中也是必不可少的，如TNF-α誘導的MEK/ERK信號通路在產(chǎn)生OA時就涉及Egr-1的DNA 結合[25]。

KEGG信號通路中，P值較為顯著的前5個依次為：proteoglycans in cancer (癌癥蛋白聚糖)、PI3K-Akt signaling pathway(磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶 B 信號通路)、Lipid and atherosclerosis(血脂和動脈粥樣硬化)、MAPK signaling pathway(MAPK信號通路)、Chemical carcinogenesis receptor activation(化學致癌受體激活)、Prostate cancer(前列腺癌)。腫瘤微環(huán)境中的許多蛋白多糖對各種類型癌癥的生物學效應如增殖、黏附、血管生成和轉移起著關鍵作用，還有些和生長因子、細胞因子等相關。癌癥蛋白聚糖信號通路中存在cross-talk，可激活TGF-β /BMPs、Wnt/β-catenin、p38MAPK、PI3K-Akt等能誘導OA的信號通路。血脂和動脈粥樣硬化信號通路一般是通過激活PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、TLR/MyD88信號通路來產(chǎn)生作用。化學致癌受體激活信號通路則是通過激活PI3K-Akt信號通路、JAK/STAT信號通路來實現(xiàn)。前列腺癌信號通路可激活PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路來起作用。此外，上述5條KEGG信號通路均涉及到細胞凋亡，而細胞凋亡是導致OA的重要原因。因此，OM可能通過上述信號通路發(fā)揮對OA的治療作用。

運用分子對接技術驗證OM與各靶點的結合性能時，發(fā)現(xiàn)對接得到的Libdockscore為92～107，說明OM對核心靶點具有一定的結合能力，但并非十分穩(wěn)定。分析OM與各核心靶點的分子間作用力種類與數(shù)量，發(fā)現(xiàn)主要依靠數(shù)目較少的傳統(tǒng)氫鍵、P-Pi 共軛、堿基孤對電子進行結合，甚至有的主要依靠碳氫鍵這種弱作用力進行結合，結合能力相對較弱。已有研究表明，由于苦參堿類天然生物堿的自身結構特點，其與眾多靶點進行對接時的Libdockscore都偏低[26]。生物堿類具有較強生理活性的同時，也有較大的不良反應，這種相對較弱的結合能力，亦可能是自然藥學觀下的機體保護作用，即藥物與受體結合發(fā)揮藥效之后盡快解離以免產(chǎn)生過多的不良反應。

本研究運用網(wǎng)絡藥理學對氧化苦參堿治療骨關節(jié)炎的作用機制進行了預測及分子對接驗證，并分析了前五個最為核心的靶點、GO條目及KEGG通路，為后續(xù)研究的模型選擇、驗證實驗提供了信息導向。