季艷菊，鐘高龍，常曉月，李 英，胡蓮美，張 輝，潘家強(qiáng)，唐兆新*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642； 2.惠州工程職業(yè)學(xué)院，惠州 516023)

免疫抑制作用是由病毒、霉菌毒素、農(nóng)用化學(xué)物質(zhì)等多種因素引起的免疫系統(tǒng)紊亂或?qū)C(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制功能。近些年來，一些免疫抑制性疾病在肉雞養(yǎng)殖中頻發(fā)，如馬立克氏病、傳染性法氏囊病和禽白血病，其能夠抑制免疫應(yīng)答，降低宿主對(duì)疫苗的敏感性，從而增加雞群的發(fā)病率和死亡率，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。現(xiàn)階段應(yīng)對(duì)這些免疫抑制疾病的策略主要是通過長(zhǎng)期的疫苗接種和適當(dāng)?shù)乃幬镏委?。但是滅活疫苗產(chǎn)生的抗體不持久，而藥物的過度使用也會(huì)產(chǎn)生諸多的食品安全問題。因此，尋找一種預(yù)防和治療免疫抑制疾病的新方法是亟待解決的問題，其中使用中草藥來增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力被認(rèn)為是最有前景的方法。

中藥具有毒性低、副作用小的優(yōu)勢(shì)，已然成為一種新穎的藥物治療手段。紫錐菊是一種傳統(tǒng)的藥用植物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、抗癌、抗病毒等作用。免疫調(diào)節(jié)是紫錐菊重要的生物活性作用，能夠增加宿主的免疫和抗感染能力。研究發(fā)現(xiàn)，紫錐菊乙醇提取物對(duì)流感病毒H1N1、H5N1、H7N7有良好的抑制作用。同時(shí)，飼料中添加紫錐菊能顯著促進(jìn)注射藍(lán)耳病弱病毒仔豬的生長(zhǎng)及弱病毒的免疫效果。可見紫錐菊具有一定免疫調(diào)節(jié)作用，可作為一種潛在的免疫誘導(dǎo)劑。環(huán)磷酰胺是一種免疫抑制劑，也是一種抗腫瘤藥物，在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)造成機(jī)體免疫力降低，誘發(fā)多個(gè)系統(tǒng)的慢性疾病。已有研究表明，紫錐菊可以提高肉雞的生長(zhǎng)性能和免疫器官指數(shù)(脾、胸腺、法氏囊)，并對(duì)免疫抑制雞的免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)功能。脾是機(jī)體內(nèi)最大的外周淋巴器官，也是免疫反應(yīng)的重要部位，但目前關(guān)于紫錐菊對(duì)免疫抑制雞脾組織保護(hù)作用的潛在機(jī)制尚不清楚。因此，本研究利用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制動(dòng)物模型探討紫錐菊對(duì)免疫抑制雞的免疫調(diào)節(jié)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及處理

120羽1日齡雛雞適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組、紫錐菊組、環(huán)磷酰胺+紫錐菊組(聯(lián)合組)，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30羽。對(duì)照組和紫錐菊組雛雞連續(xù)3 d胸肌注射等量的生理鹽水，環(huán)磷酰胺組和聯(lián)合組雛雞連續(xù)3 d按80 mg·kg體重注射生理鹽水配制的環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制模型，紫錐菊組和聯(lián)合組每天飼喂含有紫錐菊全草粉末的基礎(chǔ)日糧(含量為1%)，其余各組飼喂基礎(chǔ)日糧。試驗(yàn)期間雛雞自由飲水，給予光照每天12 h，第1周室溫控制在31～33 ℃，每過1周 溫度降1～2 ℃。每天稱重并記錄每只雞的重量，連續(xù)飼喂21 d，并觀察雛雞的生長(zhǎng)情況。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每重復(fù)組隨機(jī)選取6只雞，稱取體重，迅速采集脾并稱重，并計(jì)算脾臟指數(shù)。取一部分脾用預(yù)冷PBS(磷酸鹽緩沖液)清洗后放入4%的多聚甲醛中，用于形態(tài)學(xué)病理檢測(cè)。其余的放入凍存管于液氮之中暫存，用于分子檢測(cè)。

1.2 試驗(yàn)試劑和儀器

TRIzol購自TaKaRa公司；Prime Script RT Master Mix、2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；RIRA裂解液購自Beyotime公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒(12.5%)購自上海雅酶生物科技有限公司；炎癥抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；紫錐菊全草購自安國(guó)市宏宇中藥材公司，產(chǎn)地河北。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

TDZ5-WS型冷凍離心機(jī)，購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；5200型凝膠成像系統(tǒng)，購自上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；LightCycler480型熒光定量PCR儀，購自美國(guó)Bio-Rad公司；Unique-R10型超純水儀，購自廈門銳思捷科學(xué)儀器有限公司；DM1000型光學(xué)顯微鏡，購自廣州德真科學(xué)儀器有限公司。

1.3 脾組織重量分析

分離的脾組織用濾紙吸干表面血液，稱重并記錄。并計(jì)算脾臟指數(shù)：脾臟指數(shù)=脾重量(g)×100%/體重(g)。

1.4 病理切片的制備

分離的脾組織在4%的多聚甲醛中固定24 h后，在梯度酒精中脫水，二甲苯透明，放入蠟機(jī)中制成石蠟塊。切片機(jī)將組織蠟塊切成5 μm厚的切片，經(jīng)烤片、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、100%、90%、80%、70%、60%的梯度酒精復(fù)水(各3 min)，蘇木精染色，1%的鹽酸酒精分色，自來水反藍(lán)15 min， 60%、70%、80%、90%的梯度酒精脫水(各3 min)，伊紅染色，100%酒精(2次)、二甲苯Ⅲ(5 min)、二甲苯Ⅳ(10 min)，封片，光學(xué)顯微鏡先觀察并拍照。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

稱取脾組織50 mg，提取總RNA，其方法按照TaKaRa試劑盒說明書進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，RNA濃度用NanaDrop-2000微量核算測(cè)定儀檢測(cè)。作為看家基因。引物由Prime Express 5設(shè)計(jì)，由生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行。隨后進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)總體系為10 μL：其中cDNA 1 μL, 2× Cham Q SYBR qPCR Master Mix 5 μL，上、下游引物均為0.4 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；進(jìn)行40次循環(huán)；檢測(cè)-、、-2、-4、-6、-、-、2、4、7、88的mRNA水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 蛋白免疫印跡

用蛋白免疫印跡法檢測(cè)雞脾組織 NF-κB、p-NF-κB、 IκB、p-IκB、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ和TLR4的蛋白表達(dá)量，以β-tubulin和GAPDH作為內(nèi)參。稱取雞脾組織30 mg，加500 μL RIPA裂解液冰上勻漿、離心(12 000×，4 ℃，15 min)取上清獲得總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后稀釋至同一濃度，煮沸10 min后-80 ℃保存。采用12.5% SDS-聚丙酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，通過轉(zhuǎn)膜將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBST洗滌3次，每次5 min，5%的脫脂牛奶封閉1 h，目的蛋白相應(yīng)的一抗4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗滌3次，然后與相應(yīng)二抗搖床室溫孵育1 h，后用TBST充分洗滌。ECL發(fā)光液顯影，拍照并分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel 2019初步處理，數(shù)據(jù)均以“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)”表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，使用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行做圖。<0.05 被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 紫錐菊對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能降低肉雞一般狀況的影響

如圖1A 所示，注射環(huán)磷酰胺后，在14 d時(shí)，環(huán)磷酰胺組雛雞體重和對(duì)照組相比顯著降低(<0.05)，而其他組無明顯差異。在21日齡時(shí)，紫錐菊組雛雞體重和對(duì)照組相比極顯著增加(<0.001)， 而環(huán)磷酰胺組雛雞生長(zhǎng)遲緩(<0.05)，聯(lián)合組雛雞體重顯著高于環(huán)磷酰胺組雛雞(<0.05)。 在28日齡 時(shí)，體重差異更為明顯，紫錐菊組雛雞體重是4個(gè)組中最高的(<0.001)，而環(huán)磷酰胺組雛雞最低(<0.001)，聯(lián)合組雛雞體重較環(huán)磷酰胺組顯著增加(<0.001)。脾臟指數(shù)結(jié)果如圖1B 所示，環(huán)磷酰胺組雞的脾臟指數(shù)顯著低于對(duì)照組和聯(lián)合組(<0.05)。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型造模成功。

與對(duì)照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。聯(lián)合組與環(huán)磷酰胺組比，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001，n=6。下同Compared with control group, * indicates P < 0.05, ** indicates P<0.01, *** indicates P<0.001. The combined group vs. the cyclophosphamide group, # represents P<0.05, ## means P<0.01, ### indicates P<0.001, n=6. The same as below圖1 雞的體重(A)及脾臟指數(shù)(B)變化Fig.1 The changes in body weight(A) and spleen coefficient(B) of chickens

2.2 紫錐菊對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能降低肉雞脾組織病理學(xué)的影響

如圖2 所示，對(duì)照組雞脾結(jié)構(gòu)正常，白髓與紅髓分界線清晰，形態(tài)良好。環(huán)磷酰胺組雞脾出現(xiàn)大量空泡(紅色箭頭表示)，淋巴細(xì)胞稀疏紊亂，白髓與紅髓分界線逐漸模糊，動(dòng)脈周圍淋巴鞘增生，淋巴細(xì)胞生成減少。紫錐菊組雞脾結(jié)構(gòu)清晰，無明顯病變。聯(lián)合組雞脾淋巴細(xì)胞生成增多，間質(zhì)纖維增生減輕，空泡減少。

A～D分別為對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組、紫錐菊組、聯(lián)合組。紅箭頭指空泡A-D are the control group, the cyclophosphamide treated group, the Echinacea treated group and the combined group, respectively. Red arrows point to the vacuoles degeneration圖2 脾組織病理切片圖(200×)Fig.2 Histopathological sections of the spleen tissues (200×)

2.3 紫錐菊對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能降低肉雞脾NF-κB及TLR4信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

紫錐菊對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能降低肉雞脾炎性相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響如圖3所示。與對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺處理組的-、-2、-4、-6、-基因的mRNA表達(dá)量均顯著降低(<0.05、<0.01或<0.001)，而和-的mRNA表達(dá)量顯著升高(<0.01或<0.001)。而紫錐菊組-、-2、-4、-6、-的mRNA表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(<0.05、<0.01或<0.001)，的mRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(<0.01)，-無顯著變化。聯(lián)合組和環(huán)磷酰胺組相比，基因-、-2、-4、-6、-的表達(dá)量均顯著升高(<0.05、<0.01或<0.001)，而和-顯著下降(<0.05)。與對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺組2、4、7、88的mRNA水平均顯著下降(<0.05、<0.01或<0.001)，而紫錐菊組的88 mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(<0.001)，其余基因mRNA表達(dá)量無顯著差異。此外，聯(lián)合組相比環(huán)磷酰胺組，2、4、88的mRNA的表達(dá)水平顯著上升(<0.05，<0.001)，7的mRNA 表達(dá)量無顯著差異。

圖3 紫錐菊對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能降低肉雞的脾組織中炎性和免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Echinacea on the mRNA expression of inflammatory- and immune-related genes in spleen of immunosupressed chickens induced by cyclophosphamide

2.4 紫錐菊對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能降低肉雞脾組織NF-κB、TLR4通路相關(guān)蛋白的表達(dá)影響

結(jié)果如圖4，相比于對(duì)照組，p-NF-κB/NF-κB在環(huán)磷酰胺組顯著降低(<0.001)，而在紫錐菊組顯著升高(<0.01)，且聯(lián)合組較環(huán)磷酰胺組顯著增加(<0.001)。與p-NF-κB/NF-κB相反，環(huán)磷酰胺組p-IκB /IκB顯著高于對(duì)照組(<0.01)，而其他組則無顯著差異。與對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺組炎性因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(<0.05或<0.001)，而上述蛋白表達(dá)量在紫錐菊組則顯著增加(<0.05或<0.01)，且聯(lián)合組IL-2、 IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ的蛋白表達(dá)水平顯著高于環(huán)磷酰胺組(<0.05或<0.001)。 環(huán)磷酰胺組TLR4蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，而聯(lián)合組的TLR4蛋白表達(dá)水平則顯著高于對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組(<0.01或<0.001)。

圖4 紫錐菊對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能降低肉雞的脾組織NF-κB/TLR4通路相關(guān)蛋白的表達(dá)影響Fig.4 Effects of Echinacea on expression levels of NF-κB and TLR4 pathway-related proteins in spleen of immunosuppressed chickens induced by cyclophosphamide

3 討 論

環(huán)磷酰胺是一種廣泛用于誘導(dǎo)免疫抑制動(dòng)物模型的烷基化制劑，它可以抑制體液免疫和細(xì)胞免疫，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞發(fā)生不可逆損傷。因此，本研究利用環(huán)磷酰胺建立雞免疫抑制模型，驗(yàn)證紫錐菊在促進(jìn)雛雞生長(zhǎng)和免疫調(diào)節(jié)中的作用。動(dòng)物的生產(chǎn)性能反映了飼料對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的影響。研究表明，在豬飼料中添加紫錐菊粉末可以顯著提高育肥豬的飼料轉(zhuǎn)化率，且生長(zhǎng)性能明顯提高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，從21 ～28日齡紫錐菊組雞的體重急劇增加且顯著高于其他組，說明紫錐菊能夠提高雞的生長(zhǎng)性能，此結(jié)果與羅俊峰等的研究結(jié)果一致。體重變化可以直觀地反映動(dòng)物的生長(zhǎng)狀態(tài)；脾是禽類最重要的免疫器官，是各種免疫活性細(xì)胞發(fā)育、增殖分化的主要場(chǎng)所，免疫器官發(fā)育情況直接影響機(jī)體的免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視、防御、調(diào)控的作用，當(dāng)其受損時(shí)往往伴隨著免疫器官的損害。在本研究中，環(huán)磷酰胺組的脾臟指數(shù)顯著低于其他組，而HE染色顯示，對(duì)照組脾細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)致密，排列整齊；環(huán)磷酰胺組的脾細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞間隙明顯擴(kuò)張，紅、白髓結(jié)構(gòu)不清晰；而聯(lián)合組脾細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷得到緩解，病理變化減輕；紫錐菊組與對(duì)照組接近。本研究顯示，紫錐菊能有效緩解環(huán)磷酰胺所致脾損傷，并通過影響免疫器官發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能。有研究顯示，80 mg·kg的環(huán)磷酰胺作用的肉雞脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)顯著低于對(duì)照組。宋紅衛(wèi)等發(fā)現(xiàn)，紫錐菊的添加能夠顯著促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，提高免疫器官指數(shù)。這與本研究結(jié)果相一致。

有研究發(fā)現(xiàn)，TLR家族蛋白在先天免疫中發(fā)揮重要作用。其中TLR4在啟動(dòng)適應(yīng)性免疫、活化抗原提呈細(xì)胞和病原體識(shí)別中起著關(guān)鍵作用。TLR4的激活直接誘導(dǎo)核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)進(jìn)入細(xì)胞核形成磷酸化的NF-κB(p-NF-κB)，進(jìn)而激活免疫調(diào)節(jié)通路的級(jí)聯(lián)以及下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。而IκB(inhibitor of NF-κB)， 是NF-κB的抑制蛋白，p-IκB是其磷酸化形式，主要調(diào)節(jié)NF-κB轉(zhuǎn)錄。IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ 是受NF-κB調(diào)控的重要炎性因子，其對(duì)維持機(jī)體免疫功能具有重要的作用。有研究表明，刺參糖胺聚糖、刺五加多糖、玉竹多糖和板藍(lán)根多糖均具有較好的免疫調(diào)節(jié)功能。紫錐菊多糖在LPS致大鼠肺損傷模型中，顯著降低了白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量，減少TNF-α、IL-6和IL-1β釋放，顯示出較強(qiáng)的抗炎效果。環(huán)磷酰胺作用于小鼠后，血清蛋白IgG、IgM和IgA，抗炎性因子IL-4和IL-10顯著低于對(duì)照組。為了闡明紫錐菊的免疫調(diào)節(jié)活性是否受TLR4/NF-κB通路的調(diào)控，本研究檢測(cè)了TLR4/NF-κB通路相關(guān)的基因mRNA和蛋白的表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺組的TLR4/NF-κB通路相關(guān)因子(除外)mRNA表達(dá)水平顯著低于其他各組，而聯(lián)合組相關(guān)基因變化趨勢(shì)與環(huán)磷酰胺組結(jié)果相反。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，在環(huán)磷酰胺組NF-κB和IκB的磷酸化明顯受阻，而添加紫錐菊后得到明顯緩解，由此可見紫錐菊可激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性。

4 結(jié) 論

紫錐菊依賴于TLR4/NF-κB通路進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，并通過該通路上調(diào)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ的表達(dá)來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能。本研究結(jié)果為紫錐菊在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。