張羽晨，雷亞萍，農(nóng)碧丹，龐曉敏，張苗苗，劉曉麗，谷長勤，張萬坡，程國富，胡薛英

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

自2010年4月以來，我國不同地區(qū)陸續(xù)暴發(fā)了一種以蛋鴨產(chǎn)蛋下降為主要特征的疫病，經(jīng)病原學(xué)診斷為鴨坦布蘇病毒(duck tembusu virus, DTMUV)感染。該病發(fā)生迅速、流行范圍廣、傳播速度快、發(fā)病率和死亡率都較高，對全國大部分省市蛋鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了一定的沖擊。感染DTMUV后蛋鴨卵泡膜充血、出血，卵巢淋巴細胞浸潤，部分病鴨的卵泡膜增厚；攻毒后9 d，從卵泡膜中分離到病毒，推斷卵泡膜可能是該病毒的主要靶器官。雖然對感染DTMUV后鴨各器官的組織病理學(xué)變化進行了相關(guān)研究，但有關(guān)蛋鴨感染DTMUV后卵巢各級卵泡的病理損傷、損傷與病毒分布的關(guān)系研究并不多。本研究對自然感染DTMUV病鴨的臨床癥狀、剖檢病變、組織病理學(xué)變化及病毒抗原定位進行觀察研究，旨在進一步探究DTMUV感染卵巢的病理損傷特點，為DTMUV感染蛋鴨導(dǎo)致產(chǎn)蛋下降致病機制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

湖北省某蛋鴨場送檢病鴨，鴨場此前未免疫過DTMUV疫苗。

主要試劑及設(shè)備：鼠抗鴨坦布蘇病毒單克隆抗體(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院羅銳副教授惠贈)，黑色素A(Melan-A)抗體(A103)、廣譜細胞角蛋白(pan cytokeratin, PCK)抗體(PCK-26)、HRP標記的羊抗鼠/兔IgG均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；封閉液(5%BSA)和顯色液(DAB)購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司；GoldView為濟南莊盟生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Nikon80i生物光學(xué)顯微鏡為上海橫橋儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 病鴨的臨床癥狀觀察和剖檢 觀察感染病鴨的臨床癥狀，剖檢并觀察大體病變，取部分病鴨的腦組織置于-80 ℃冰箱保存，用于病毒檢測鑒定，部分病鴨的卵巢組織于4%多聚甲醛固定液內(nèi)固定。

1.2.2 病毒的檢測及鑒定 按照參考文獻[6]設(shè)計引物，上游引物：5′-GCCACGGAATTAGCGGTTGT-3′,下游引物：5′-TAATCCTCCATCTCAGC GGTGTAG-3′,目的片段堿基數(shù)為300 bp(由生工武漢技術(shù)部合成)，使用前瞬時離心后用適量無菌三蒸水溶解，小量分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?。取病鴨腦組織研磨成勻漿，參考北京全式金生物技術(shù)有限公司的EasyPureViralDNA/RNAKit試劑盒說明書提取含有病毒RNA的溶液，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑進行cDNA的合成，參照文獻[4]中的方法進行病毒特異性序列的擴增，反應(yīng)結(jié)束后，取擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.2.3 卵巢的組織病理學(xué)觀察 卵巢組織經(jīng)固定液固定48 h后，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度4 μm， 1張進行HE染色，3張做免疫組織化學(xué)染色備用。利用Nikon80i生物光學(xué)顯微鏡與NIS-Elements高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)進行結(jié)果觀察與記錄。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 本試驗免疫組織化學(xué)染色的步驟按照文獻[7]進行。其中，第一抗體工作濃度、修復(fù)液及修復(fù)方法見表1。

表1 免疫組織化學(xué)方法概括Table 1 Summary of immunohistochemical methodology

2 結(jié) 果

2.1 自然感染DTMUV病鴨的臨床癥狀

感染DTMUV病鴨主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋量急劇下降，產(chǎn)蛋率從90%左右下降到20%或10%，有些病鴨表現(xiàn)精神沉郁，站立不穩(wěn)，采食量下降，并伴有頭部振顫、兩腿呈游泳狀掙扎等明顯神經(jīng)癥狀(圖1)。嚴重病例痙攣倒地不起，兩腿向后踢蹬呈角弓反張，最后衰竭死亡。

圖1 自然感染鴨坦布蘇病毒病鴨的臨床癥狀Fig.1 The clinical manifestations of ducks naturally infected with duck tembusu virus

2.2 自然感染病鴨卵巢的剖檢病變

卵巢是發(fā)病蛋鴨的主要病變器官，有的病鴨生長卵泡數(shù)量減少，成熟卵泡卵泡膜可見紅色、暗紅色斑塊，個別卵泡外觀呈灰白色膠凍狀，部分成熟卵泡表面淤血(圖2A)；有的病鴨成熟卵泡數(shù)量減少，濾泡網(wǎng)血管擴張，整體呈暗紅色；輸卵管表面呈暗紅色(圖2B)；部分病鴨卵泡破裂，卵黃溢出并引起卵黃性腹膜炎，剖檢病鴨輸卵管內(nèi)均未見蛋的生成(圖2C)。

A. 成熟卵泡卵泡膜可見大小不一的暗紅色斑塊；B. 成熟卵泡呈暗紅色，數(shù)量減少；C. 卵泡表面可見暗紅色斑塊，有卵泡破裂A. Dark red patches of different sizes can be seen on the follicular membrane of mature follicles; B. Mature follicles are dark red and the number is reduced; C. Dark red patches can be seen on the surface of follicles, with ruptured follicles圖2 自然感染病鴨卵巢的病理學(xué)變化Fig.2 Gross appearance of ovary from the ducks naturally infected with duck tembusu virus

2.3 病毒的檢測與鑒定

提取病鴨腦組織內(nèi)的病毒RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑進行cDNA的合成，經(jīng)病毒特異性序列的擴增，將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以看出擴增產(chǎn)物的條帶大約300 bp，與預(yù)期擴增的片段大小一致(圖3)

M. DNA相對分子質(zhì)量標準；N. 陰性對照；P. 陽性對照；1～4. DTMUV特異性序列擴增產(chǎn)物M. DL2000 DNA marker；N. Negative control; P. Positive control; 1-4. DTMUV specific sequence amplification product圖3 鴨坦布蘇病毒擴增條帶的電泳鑒定Fig.3 Electrophoresis results of duck tembusu virus

2.4 病鴨卵巢組織病理學(xué)觀察

病鴨卵巢的組織病理學(xué)觀察顯示,卵巢表面生殖上皮細胞增生，由一層變?yōu)槎鄬?圖4A)；卵巢皮質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡狀細胞(圖4B)；卵巢皮質(zhì)內(nèi)增生的空泡狀細胞間有紅細胞滲出(圖4C)。

A. 卵巢生殖上皮細胞增生(→標注)，Bar=50 μm；B. 卵巢皮質(zhì)內(nèi)大量的空泡狀細胞(→標注)，Bar=200 μm；C. 卵巢皮質(zhì)內(nèi)紅細胞滲出(→標注)，Bar=100 μmA. Proliferation of ovarian germ epithelial cells(→labeled), Bar=50 μm; B. A large number of vacuolar cells in the ovarian cortex(→labeled), Bar=200 μm; C. Red blood cell exudation in the ovarian cortex(→labeled), Bar=100 μm圖4 病鴨卵巢的組織病理學(xué)觀察結(jié)果Fig.4 Histopathological observation of the ovaries of sick ducks

病鴨卵巢的原始卵泡未見損傷(圖5A)；可見有些生長卵泡顆粒細胞凋亡，細胞膜完整，細胞固縮紅染(圖5B)，部分卵泡顆粒細胞大量增生(圖5C)；成熟卵泡生殖上皮細胞增生腫脹(圖5D)，卵泡外膜有大量空泡狀細胞增生(圖5E)，卵泡內(nèi)膜纖維化(圖5F)，顆粒細胞空泡化，并伴有大量的異嗜性粒細胞浸潤(圖5G)，卵黃膜增生并脫落至卵泡腔內(nèi)(圖5H)；部分卵泡周圍大量結(jié)締組織和動脈增生，增生的動脈壁平滑肌細胞壞死并見大量炎性細胞浸潤(圖5I)。

A. 原始卵泡無明顯損傷，Bar=100 μm；B. 顆粒細胞凋亡(→標注)，Bar=50 μm；C. 顆粒細胞增生(→標注)，Bar=50 μm；D. 卵泡生殖上皮細胞增生腫脹(→標注)，Bar=50 μm；E. 卵泡周圍空泡狀細胞增生(→標注)，Bar=100 μm；F. 卵泡內(nèi)膜纖維化(→標注)，Bar=50 μm；G. 成熟卵泡顆粒細胞空泡化(→標注)，Bar=50 μm；H.卵黃膜增生(→標注)，Bar=5 0 μm；I. 動脈平滑肌壞死，有大量的炎性細胞浸潤(→標注)，Bar=50 μmA. No obvious damage to primordial follicles, Bar=100 μm; B. Apoptosis of granulosa cells(→labeled), Bar=50 μm; C. Hyperplasia of granulosa cells(→labeled), Bar=50 μm; D. Proliferation and swelling of germ epithelial cells(→labeled), Bar=50 μm; E. Increased stromal cells in follicles(→labeled), Bar=50 μm; F. Fibrosis of follicular inner membrane(→labeled), Bar=50 μm; G. Mature follicular granulosa cells are vacuolated(→labeled), Bar=50 μm; H. Vitelline membrane hyperplasia(→labeled), Bar=50 μm; I. Arterial smooth muscle fibrosi(→labeled), Bar=50 μm圖5 病鴨卵泡的組織病理學(xué)觀察結(jié)果Fig.5 Histopathological observation of the follicles of sick ducks

2.5 病鴨卵巢的免疫組織化學(xué)染色

病鴨卵巢的IHC結(jié)果顯示，分布于卵巢表面的生殖上皮細胞PCK表達陽性(圖6A)，卵泡周圍增生的大量空泡狀細胞中PCK呈陽性表達(圖6B)；Melan-A的染色結(jié)果顯示，生長卵泡和成熟卵泡的顆粒細胞呈陽性表達(圖6C)，卵泡膜細胞和生殖上皮細胞呈陰性；DTMUV的染色結(jié)果顯示，卵泡中顆粒細胞表達陽性，卵泡膜細胞和生殖上皮細胞表達陰性(圖6D)。

A.卵巢生殖上皮細胞PCK呈陽性反應(yīng)(→標注)，Bar=50 μm；B.卵泡周圍增生的空泡狀細胞PCK呈陽性反應(yīng)(→標注)，Bar=100 μm；C.卵泡顆粒細胞Melan-A呈陽性表達(→標注)，Bar=50 μm；D：卵泡顆粒細胞DTMUV呈陽性表達(→標注)，Bar=50 μmA. Ovarian germ epithelial cells PCK positive(→labeled), Bar=50 μm; B. Ovarian mesenchymal cell hyperplasia(→labeled), PCK positive, Bar=100 μm; C. Ovarian granulosa cell Melan-A positive(→labeled), Bar=50 μm; D. Granulosa cell DTMUV positive(→labeled), Bar=50 μm圖6 病鴨卵巢的免疫組織化學(xué)結(jié)果Fig.6 Immunohistochemical results of sick duck ovary

3 討 論

于春梅等研究表明，攻毒后3 d各組織TMUV的相對表達量都較高，其中，卵泡和輸卵管最高；通過試驗發(fā)現(xiàn)感染DTMUV病鴨剖檢可見卵泡充血、出血和液化；組織病理學(xué)變化為卵巢組織中異嗜性粒細胞浸潤，卵泡顆粒細胞脫離基底膜，隨后壞死、崩解，卵黃溶解；王偉等研究發(fā)現(xiàn)，鴨腿部肌肉注射DTMUV液11 d后卵巢仍存在萎縮，無正常發(fā)育卵泡形成。本研究發(fā)現(xiàn)病鴨感染DTMUV后，臨床表現(xiàn)病鴨產(chǎn)蛋量明顯下降，卵泡充血、出血、液化。組織病理學(xué)變化為卵泡的顆粒細胞增生、凋亡和壞死，大量異嗜性粒細胞浸潤，這些變化與文獻報道一致。

本研究運用免疫組織化學(xué)方法，進一步觀察了DTMUV在卵巢中的分布，結(jié)果顯示，DTMUV分布在卵泡的顆粒細胞中。家禽卵巢中有數(shù)以千計的卵泡，產(chǎn)蛋期卵巢中存在著大小不等的卵泡，形成了家禽特有的等級卵泡，家禽卵泡發(fā)育和等級建立是一個由多因素調(diào)控的復(fù)雜的生物學(xué)過程。顆粒細胞是卵巢的體細胞之一，在卵泡的發(fā)育及閉鎖中具有重要的作用，顆粒細胞能夠產(chǎn)生并分泌孕酮激素，在卵泡結(jié)構(gòu)的膜細胞層轉(zhuǎn)化成雄激素和雌激素，并分泌HDL樣顆粒為卵母細胞提供脂質(zhì)體，為生物膜的合成做準備，對卵母細胞發(fā)育起促進作用；張少偉研究提示：隨著家禽從未開產(chǎn)期進入開產(chǎn)期，必然會伴隨著卵巢體積的增大和重量的增加，卵泡閉鎖是造成進入等級的卵泡數(shù)量減少、產(chǎn)蛋量下降的主要原因。本研究表明感染DTMUV后生長卵泡和成熟卵泡的顆粒細胞由于DTMUV的侵襲，顆粒細胞增生、凋亡和壞死，引起卵泡閉鎖，造成蛋鴨產(chǎn)蛋量下降。

本研究還發(fā)現(xiàn)病鴨卵巢的原始卵泡無明顯損傷，這印證了感染DTMUV后蛋鴨的產(chǎn)蛋能力恢復(fù)的現(xiàn)象，但DTMUV如何侵襲卵泡的顆粒細胞進而損傷卵巢致病機制有待進一步研究。

4 結(jié) 論

感染DTMUV后，病鴨卵泡充血、出血、破裂，組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),病毒主要分布在生長卵泡和成熟卵泡的顆粒細胞，顆粒細胞發(fā)生增生、凋亡或壞死。由于顆粒細胞的病變，導(dǎo)致卵泡閉鎖，進而引起蛋鴨產(chǎn)蛋量下降。