趙鳳軍，張艷紅*

(1.遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東 118003；2.遼東學(xué)院 現(xiàn)代特色農(nóng)業(yè)研究院，遼寧 丹東 118003)

遼寧露地杜鵑花(Rhododendron)資源種類共8種。其中，本土野生杜鵑花5種，分別是迎紅杜鵑(R.mucronulatum)、大字杜鵑(R.schlippenbachii)、照白杜鵑(R.micranthum)、興安杜鵑(R.dauricum)、牛皮杜鵑(R.aureum)；引種栽培成功的杜鵑花共3種，分別是紅楓杜鵑(R.hybridecv.Hongfeng)、北漢山杜鵑(R.yedoensevar.poukhanense)、淀川杜鵑(R.yedoense)[1]。溫室栽培的園藝杜鵑花品種有200多種，其中日本石巖杜鵑(R.obtusum)具有一定的耐寒性，在丹東市氣候條件較好的位置可以越冬，而其它園藝品種在室外無法存活，因此耐寒性成為制約北方杜鵑花栽培的首要因素。

研究表明，植物在越冬期間營養(yǎng)物質(zhì)的積累轉(zhuǎn)化與抗寒性密切相關(guān)[2-6]。如在對葡萄屬(Vitis)與蘋果屬(Malus)植物越冬期間枝條中淀粉粒形態(tài)結(jié)構(gòu)和動態(tài)變化與其抗寒性的關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，枝條組織細胞中淀粉粒的大小、積累數(shù)量和轉(zhuǎn)化動態(tài)規(guī)律與抗寒性密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為抗寒種類或品種的淀粉粒小，積累早而數(shù)量多，水解晚但速度快且較徹底[2-4]。而牡丹(Paeoniasuffruticosa)根部組織切片顯示出深度休眠期與生長期相比，韌皮部中淀粉粒增加較多，與植物抗寒能力有一定關(guān)系[5]。北京地區(qū)5種常綠闊葉植物的細胞中，在10月下旬都有較多的淀粉粒分布，在11—12月淀粉粒含量顯著下降，3—4月又開始積累淀粉粒?？梢?，淀粉粒的季節(jié)性動態(tài)變化與植物的抗寒性發(fā)育及越冬適應(yīng)性具有高度一致性[6]。

在北方能露地越冬的杜鵑花品種較少，影響杜鵑花抗寒性的相關(guān)因素較多，目前研究主要集中于分析可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、丙二醛(MDA)、過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、游離脯氨酸(PRO)等與杜鵑花抗寒性的關(guān)系[7-8]，鮮有涉及杜鵑花枝條淀粉粒與抗寒性關(guān)系的相關(guān)報道。本研究以遼寧丹東6種露地栽培杜鵑花為材料，分析越冬期間枝條淀粉粒動態(tài)，同時測定其半致死溫度，以揭示杜鵑花枝條中的淀粉粒含量與其抗寒性的關(guān)系，以期為杜鵑花在園林中的推廣、應(yīng)用和研究提供參考，也為開展低溫脅迫下杜鵑花生理適應(yīng)機制、抗寒杜鵑花育種等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用試驗材料(表1)均來源于遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院校外基地的杜鵑花花圃(N40°13′18.66″，E124°19′41.13″)。除石巖杜鵑外，其他品種均為露地栽培的5 a以上樹齡的植株，越冬期間不進行防寒處理，栽培管理條件一致，植株生長健壯，株高約1.0 m、冠幅約0.6 m。栽植地土壤為沙壤土，pH值為5.5，年平均降雨量多在800～1 200 mm，年最低氣溫達-28 ℃。石巖杜鵑只能在背風(fēng)向陽的小氣候好的位置越冬，在圃地采用覆蓋防寒。

表1 試驗材料名稱、來源

1.2 方法

在2019年9月中旬(T1)、10月末(T2)、12月中旬(T3)，2020年2月初(T4)、5 月初(T5) 5個時期，分別采集6種杜鵑花的當(dāng)年生、生長勢一致、無病蟲害且充分成熟的枝條中段(梢部和基部各去掉2 cm)，將采集后的枝條切成3 cm左右小段，每個品種以3個不同枝段做重復(fù)實驗。然后立即投入編好號的裝有卡諾氏固定液的干凈玻璃小瓶中，固定12 h后先后用體積分?jǐn)?shù)95%和85%酒精浸洗約20 min，然后保存在體積分?jǐn)?shù)70%酒精中備用。使用滑走式切片機切片，厚度為15～20 μm，每個樣品每次做5個樣片。采用高碘酸-希夫染色試劑對切片進行染色，并用香柏油封片。待制片風(fēng)干后在顯微鏡下觀察其淀粉粒情況，并對淀粉粒著色明顯的部分進行照相記錄。利用卡爾蔡司ZEN軟件測量切片在40倍物鏡下視野中淀粉粒所占面積百分比，并以此作為淀粉粒含量數(shù)值，重復(fù)測量3個同期的圖片。

于2019年11月剪取6種杜鵑花成熟良好的一年生枝，分組進行冷凍處理，處理溫度梯度為-20、-25、-30、-35、-40 ℃。達到第一個目的溫度后，維持12 h，隨機取樣5份，同時調(diào)低溫度5 ℃，以下依此類推。取出的樣品在室內(nèi)放置12 h，然后放入盛有蒸餾水的試管中靜置2 h，用DDS-11A 型電導(dǎo)率儀測定樣品的初電導(dǎo)率，封口后，于沸水中煮20 min，冷卻到室溫，再測定終電導(dǎo)率。采用電導(dǎo)法及恢復(fù)生長試驗，并配合Logistic方程，綜合確定不同品種杜鵑花枝條的半致死溫度(LT50)[9]，Logistic方程回歸模型為：y=k/(1+ae-bx)，其中y代表相對電導(dǎo)率，x代表處理溫度，e為自然常數(shù)，k為細胞傷害率的飽和容量，a、b為方程參數(shù)。通過直線回歸的方法求得a、b值及相關(guān)系數(shù)r，曲線的拐點x=lna/b，即為半致死溫度(LT50)。本試驗采用改進的數(shù)學(xué)分析方法(k=100)求得半致死溫度(LT50)[10]，據(jù)此明確各品種的抗寒性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用WPS Office進行數(shù)據(jù)整理，并用DPS7.55軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果分析

2.1 杜鵑花枝條中淀粉粒的分布與密度

杜鵑花枝條中的淀粉粒主要分布在髓、木射線、韌皮部薄壁細胞及皮層薄壁細胞中,尤以髓部細胞中最多(后面的分析以髓部細胞為例)。淀粉粒在髓部細胞中呈分散狀態(tài)，當(dāng)數(shù)量積累多時，相互粘連，重疊密集在一起。染色后著色的淀粉粒呈現(xiàn)紫紅色圓粒(圖1和圖2)。

顯微鏡下觀察到，相同種類杜鵑花的枝條髓部細胞內(nèi)淀粉粒在不同時期分布密度不同，但形態(tài)、大小基本一致(文后附圖版)。不同種類的杜鵑花枝條中的淀粉粒的分布大小等有所差異，大字杜鵑和石巖杜鵑的淀粉粒較大且分布較松散，其他4種淀粉粒相比之下較小且分布緊實(文后附圖版)。

2.2 杜鵑花枝條髓部淀粉粒含量及變化

不同種類杜鵑花枝條中淀粉粒在不同時期含量不同，但都在2月份達到最低點(表2及文后附圖版)。照白杜鵑淀粉粒含量在9、10月份逐漸積累，在休眠前達峰值，顯著高于另外3個時期(P<0.01)，后期淀粉粒含量變化趨勢與迎紅杜鵑變化趨勢一致，但含量高于迎紅杜鵑；大字杜鵑淀粉粒含量變化與其他4種杜鵑的變化不一致，其在12月份達最高含量，但與另外3個時期差異不顯著，只與含量最低的2月份差異顯著(P<0.01)；北漢山杜鵑淀粉粒含量在9、10月份逐漸積累達高峰值，顯著高于另外3個時期(P<0.01)；淀川杜鵑淀粉粒含量在10月份最高，各時期淀粉粒含量差異達極顯著水平(P<0.01)；迎紅杜鵑各時期淀粉粒含量差異達極顯著水平(P<0.01)，休眠前(10月份)達最高水平，后逐漸分解，5月份又開始重新積累；石巖杜鵑淀粉粒含量變化趨勢與大字杜鵑淀粉粒含量變化趨勢基本一致。總體上，6種杜鵑花枝條中淀粉粒的含量變化呈現(xiàn)出“升—降—升”的“倒S型”曲線[11]。

表2 越冬期間杜鵑花枝條髓部淀粉粒在40倍物鏡下面積所占百分比 單位：%

不同種類杜鵑花淀粉粒開始積累的時期不同，北漢山杜鵑、大字杜鵑、石巖杜鵑在9月中旬和10月末淀粉粒含量基本相同，說明開始積累的時間早于9月中旬，而迎紅杜鵑、照白杜鵑和淀川杜鵑開始積累的時間較晚，除大字杜鵑外，都在10月末達到高峰；在2月初淀粉粒分解最徹底的有迎紅杜鵑、北漢山杜鵑，并在5月初重新積累；而石巖杜鵑只有少量分解。越冬期間淀粉粒含量變化幅度由大到小依次為迎紅杜鵑、照白杜鵑、北漢山杜鵑、淀川杜鵑、大字杜鵑、石巖杜鵑。

2.3 低溫處理下杜鵑花的半致死溫度

依據(jù)不同種類杜鵑花枝條的初電導(dǎo)率、終電導(dǎo)率及恢復(fù)生長試驗結(jié)果，經(jīng)Logistic方程擬合得出6種杜鵑花枝條的半致死溫度(LT50，表3)。從半致死溫度所反映的抗寒性來看，6種杜鵑花抗寒性由強至弱順序依次為迎紅杜鵑、照白杜鵑、北漢山杜鵑、淀川杜鵑、大字杜鵑、石巖杜鵑。這與越冬期間淀粉粒含量變化幅度由大到小的順序一致。

表3 杜鵑花枝條的半致死溫度

2.4 杜鵑花枝條淀粉粒變化與其抗寒性的關(guān)系

不同時期杜鵑花枝條淀粉粒含量與其抗寒性的相關(guān)性分析結(jié)果(表4)表明：在10月份，杜鵑花枝條淀粉粒含量與抗寒性呈顯著負相關(guān)，即淀粉粒含量越高，抗寒性越好；在2月份，淀粉粒含量與抗寒性呈顯著正相關(guān)，即淀粉粒含量越高，抗寒性越差。

表4 不同時期杜鵑花枝條淀粉粒含量與其抗寒性的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

對北方露地杜鵑花枝條淀粉粒含量與其抗寒性的研究表明，同種杜鵑花枝條髓部及木射線細胞內(nèi)淀粉粒的形態(tài)、大小在不同時期基本一致，同一時期不同種類的杜鵑花枝條中的淀粉粒的分布密度、大小等有所差異。6種杜鵑花抗寒性由強至弱順序依次為迎紅杜鵑、照白杜鵑、北漢山杜鵑、淀川杜鵑、大字杜鵑、石巖杜鵑；同時，杜鵑花枝條中淀粉粒含量與其抗寒性密切相關(guān)，10月份枝條淀粉粒含量與抗寒性呈顯著負相關(guān)，而2月份枝條淀粉粒含量與抗寒性呈顯著正相關(guān)。

6種杜鵑花枝條髓部中淀粉粒積累的早晚、數(shù)量、轉(zhuǎn)化的速度和幅度明顯不同。在休眠前淀粉粒豐富、休眠期充分水解、解除休眠時重新積累明顯的杜鵑花抗寒性較強。其中，抗寒性最強的迎紅杜鵑枝條髓部細胞內(nèi)的淀粉粒含量變化幅度最大，淀粉粒小且緊實，初期積累量最多，天氣寒冷時水解快且明顯，天氣轉(zhuǎn)暖時重新積累效果明顯(文后附圖版組圖5)。相反，抗寒性最弱的石巖杜鵑枝條髓部細胞內(nèi)的淀粉粒大且分布很松散，越冬期間含量變化幅度最小，積累量最少且分解很少(文后附圖版組圖6)。北漢山杜鵑和淀川杜鵑作為從朝鮮引進的品種，比丹東自然分布的大字杜鵑抗寒性還強，可以向北推廣應(yīng)用。因此，杜鵑花在越冬期間淀粉的積累轉(zhuǎn)化可以作為鑒定杜鵑花品種抗寒性的重要指標(biāo)之一。

淀粉作為儲藏物質(zhì)在嚴(yán)冬來臨前大量積累，隨著溫度下降可能激活了淀粉酶活性，使淀粉水解成糖的生理過程比較活躍，從而引起植物基因表達的改變，從本質(zhì)上增加了植物抗寒性。其中大字杜鵑的耐寒能力與張艷紅在2009年所測結(jié)果有差異[8]，可能原因主要有2點：一是試驗材料生長地條件不同影響了植物的生長狀態(tài)；二是植物生長的年限不同，在生長特性上也會發(fā)生變化。由此說明植物耐寒性的表現(xiàn)受到多種因素的影響，除遺傳因素外還與地區(qū)生態(tài)條件、栽培管理等有關(guān)，這些因素通過影響植株生長狀況及養(yǎng)分積累轉(zhuǎn)化的早晚及程度，從而影響到植株抗寒基因的表達。