潘厚軍 鄧美玲 古欣婷 鄭巧銀 劉雨果

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510380;2.廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,東莞 523808)

青蒿素是中國(guó)科學(xué)家從傳統(tǒng)中藥青蒿中分離得到的倍半萜內(nèi)酯類化合物的一種,是抗瘧疾特效藥物[1]。雙氫青蒿素是青蒿素在體內(nèi)的有效活性代謝產(chǎn)物之一,在體外可由四氫硼鈉還原青蒿素而得到。雙氫青蒿素不僅能有效防治瘧原蟲[2],對(duì)其他寄生蟲同樣具有較好的殺滅效果[3—8]。很多寄生蟲病分布范圍廣,對(duì)人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成巨大危害。如車輪蟲和多子小瓜蟲是引起水生動(dòng)物患病和死亡的主要寄生蟲,對(duì)水生生態(tài)和養(yǎng)殖業(yè)造成極大的損害[8];血吸蟲能引起人獸共患的血吸蟲病,對(duì)該病的防治在公共衛(wèi)生方面的重要性僅次于瘧疾[9]。由于寄生蟲離體培養(yǎng)困難,并且寄生蟲材料來(lái)源難以穩(wěn)定獲得,因此采用與寄生蟲分類地位相近的替代模式生物,對(duì)于研究青蒿素類藥物抗寄生蟲的作用機(jī)制具有重要作用。

嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)隸屬于原生動(dòng)物門纖毛亞門,可在淡水環(huán)境中營(yíng)自由生活。嗜熱四膜蟲是重要的單細(xì)胞真核模式生物,遺傳背景清楚且基因組序列的數(shù)據(jù)庫(kù)完備,以其為對(duì)象在細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域取得了一系列成果[10,11]。此外嗜熱四膜蟲能在無(wú)菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單,個(gè)體小且繁殖周期短。大量研究表明,嗜熱四膜蟲是研究藥物[12]、有機(jī)化合物[13]和無(wú)機(jī)物[14]等外源化學(xué)物質(zhì)潛在毒性的良好模式生物。

線粒體是機(jī)體能量代謝的中心,還參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)[15]。線粒體介導(dǎo)的途徑在青蒿素類藥物誘導(dǎo)瘧原蟲細(xì)胞毒性中發(fā)揮重要作用[2]。線粒體通路途徑可通過(guò)改變線粒體膜通透性,引起線粒體膜電位降低和活性氧類增加,促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或死亡[16,17]。本文利用能體外培養(yǎng)的嗜熱四膜蟲為試驗(yàn)對(duì)象,在嗜熱四膜蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中定量加入不同劑量的雙氫青蒿素,研究DHA對(duì)細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)行為等生理方面和細(xì)胞增殖、線粒體功能、氧化還原水平等生化方面的影響,探討DHA對(duì)嗜熱四膜蟲的毒性作用,為評(píng)估青蒿素類藥物在抗蟲方面潛在的藥用價(jià)值提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

嗜熱四膜蟲(B2086.2株由美國(guó)康奈爾大學(xué)贈(zèng)送)蟲種以5% 的體積分?jǐn)?shù)接種于裝有5 mL Neff培養(yǎng)液(0.25% 蛋白胨、0.25% 酵母提取物、0.5%葡萄糖和 9 g/L的FeCl3母液按0.1% 體積比加入)的試管中,于30℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)48h后,將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的嗜熱四膜蟲蟲液轉(zhuǎn)移擴(kuò)大培養(yǎng)。

雙氫青蒿素的配制:0.1 g DHA(99.9%,中國(guó)食品藥品檢定研究院)用少量二甲基亞砜(DMSO)溶解,配制成0.2 mol/L DHA儲(chǔ)備液,使用時(shí)用適量培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

采用CCK8法測(cè)定雙氫青蒿素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞增殖的影響。移取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的嗜熱四膜蟲按1×104個(gè)細(xì)胞/mL接種于10 mL新鮮培養(yǎng)液中。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)置DHA暴露組(濃度分別為40、80、160和320 μmol/L),陰性對(duì)照組(0.01% DMSO)和空白對(duì)照組(無(wú)蟲體的培養(yǎng)液),在30℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24h、48h和72h。吸取100 μL至96孔板,參考CCK8試劑盒(CK04-500T,東仁化學(xué)科技上海有限公司)說(shuō)明書所述方法,用酶標(biāo)儀(800TS,美國(guó)伯騰儀器有限公司)于450 nm處測(cè)定吸光度(A)值。細(xì)胞增殖活力(%)=(A1-A0)/(A2-A0)×100%(其中A1、A2和A0分別為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白組的A值)。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 嗜熱四膜蟲細(xì)胞形態(tài)觀察

移取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的嗜熱四膜蟲按1×104個(gè)細(xì)胞/mL接種于10 mL新鮮培養(yǎng)液中。設(shè)置DHA暴露組(濃度分別為40、80、160和320 μmol/L)和對(duì)照組(0.01% DMSO)。于30℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)48h。各組分別取200 μL依次加入24孔板中,倒置顯微鏡(Ti-S,日本Nikon公司)下觀察細(xì)胞數(shù)目,形態(tài)和運(yùn)動(dòng)狀況。為了進(jìn)一步觀察細(xì)胞凋亡特征,于培養(yǎng)48h 后,3200 r/min離心5min收集細(xì)胞,棄上清。加沉淀2—3倍體積的Hoechst 33258染色液(C1017,上海碧云天生物技術(shù)有限公司),室溫避光培養(yǎng)20min,3200 r/min離心5min棄染液。用磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH 7.4)洗2次,取20 μL細(xì)胞懸液滴在載玻片上,加入抗熒光淬滅封片液(P0126,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。熒光顯微鏡(X73,日本Olympus公司)下觀察細(xì)胞核形態(tài)。

1.4 線粒體膜電位分析

細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組同1.3。取DHA處理48h后的細(xì)胞,經(jīng)自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù),收集4×104個(gè)細(xì)胞。按 JC-1試劑盒(C2006,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)使用說(shuō)明書要求操作,配置JC-1工作液及JC-1緩沖液(使用前稀釋至1×),四膜蟲細(xì)胞置于JC-1工作液,37℃ 染色20min,離心取上清,加JC-1緩沖液重懸離心,重復(fù)洗滌2次后用適量JC-1緩沖液重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀(FACSCanto Ⅱ,美國(guó)BD公司)檢測(cè),分別采集紅色熒光(激發(fā)波長(zhǎng)525 nm,發(fā)射波長(zhǎng)585 nm)和綠色熒光(激發(fā)波長(zhǎng)490 nm,發(fā)射波長(zhǎng) 530 nm)下的圖像。橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度,縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量,以紅/綠熒光強(qiáng)度比值表示線粒體膜電位。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 嗜熱四膜蟲抗氧化酶活力

細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組同1.3。取DHA處理48h后的細(xì)胞,以3200 r/min離心5min收集細(xì)胞,棄上清。用生理鹽水洗2次后加入一定量的PBS使細(xì)胞重新懸浮,經(jīng)液氮反復(fù)凍融使細(xì)胞裂解。將細(xì)胞懸液在4℃ 3200 r/min離心5min,取上清液待測(cè)。超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)和琥珀酸脫氫酶(SDH)測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所研制試劑盒,按照相關(guān)說(shuō)明書操作經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,采用 SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理分析。單因素方差分析(One way ANOVA)檢驗(yàn)組間是否存在顯著性差異,如果存在顯著性差異,通過(guò)Tukey分析法進(jìn)行多重比較,顯著性差異水平采用P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 雙氫青蒿素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞增殖的影響

DHA作用嗜熱四膜蟲24h、48h和72h后,采用CCK-8法檢測(cè)各濃度組、各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況(圖1)。隨著濃度增加,嗜熱四膜蟲細(xì)胞增殖活力下降,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。24h下,40與80 μmol/L組,80與160 μmol/L組的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在48h和72h下各時(shí)間點(diǎn)組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),表現(xiàn)為增殖活力與濃度呈負(fù)相關(guān)。在相同DHA作用濃度下,細(xì)胞增殖隨著時(shí)間增加表現(xiàn)為逐漸降低,72h時(shí)細(xì)胞增殖活力最低。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取DHA暴露48h作為時(shí)間樣點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 雙氫青蒿素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The effect of DHA on the proliferation of Tetrahymena thermophila

2.2 雙氫青蒿素對(duì)嗜熱四膜蟲形態(tài)及運(yùn)動(dòng)的影響

倒置顯微鏡下觀察結(jié)果見(jiàn)圖 2,對(duì)照組嗜熱四膜蟲細(xì)胞呈橢圓長(zhǎng)梨狀,細(xì)胞數(shù)目多,活動(dòng)速度快。DHA作用下各濃度組嗜熱四膜蟲形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞皺縮變圓,胞質(zhì)內(nèi)空泡明顯;同時(shí)隨著濃度增大,細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制,活動(dòng)速度逐漸減慢。與對(duì)照組比較,160和320 μmol/L濃度組DHA處理細(xì)胞可見(jiàn)數(shù)量明顯減少,出現(xiàn)細(xì)胞破裂和異常細(xì)胞形態(tài)。

圖2 雙氫青蒿素對(duì)嗜熱四膜蟲形態(tài)的影響 (比例尺=20 μm)Fig.2 The effect of dihydroartemisinin on morphology of Tetrahymena thermophila (Scale bar=20 μm)

Hoechst 33258核染色結(jié)果見(jiàn)圖 3。與對(duì)照組比較,40和80 μmol/L濃度組DHA處理后細(xì)胞核形態(tài)沒(méi)有發(fā)生明顯變化。160和320 μmol/L濃度組DHA處理后,細(xì)胞核呈濃染致密的顆粒狀熒光,且胞核固縮變小,并出現(xiàn)凋亡小體(圖3箭頭指示)。

2.3 雙氫青蒿素對(duì)嗜熱四膜蟲線粒體膜電位水平的影響

圖4中的細(xì)胞散點(diǎn)圖所示,對(duì)照組細(xì)胞集中在左下區(qū),紅色熒光強(qiáng),線粒體膜電位高。隨著DHA濃度的增加,綠色熒光強(qiáng)度增加,右下區(qū)細(xì)胞逐漸增多。對(duì)照組與40、80、160和320 μmol/L DHA實(shí)驗(yàn)組的紅/綠熒光比值分別為(1.13±0.28)、(0.93±0.13)、(0.93±0.27)、(0.14±0.18)和(0.12±0.31)。與對(duì)照組相比,160和320 μmol/L濃度組DHA處理后細(xì)胞的紅/綠熒光比值顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這說(shuō)明在一定濃度下雙氫青蒿素可使嗜熱四膜蟲細(xì)胞線粒體膜電位下降。

圖4 雙氫青蒿素對(duì)嗜熱四膜蟲細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.4 The effect of dihydroartemisinin on mitochondrial membrane potential of Tetrahymena thermophila

2.4 雙氫青蒿素對(duì)嗜熱四膜蟲酶活力的影響

不同濃度DHA作用嗜熱四膜蟲后,其抗氧化酶活力和SDH水平見(jiàn)表 1。在40、80和160 μmol/L DHA作用下,細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-Px、GST和CAT活性明顯高于對(duì)照組(P＜0.05),320 μmol/L DHA作用下細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-PX活性明顯低于對(duì)照組(P＜0.05),GST和CAT活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。隨著DHA濃度增加,抗氧化酶活力呈先升高后降低的趨勢(shì)。DHA作用下各濃度組與對(duì)照組相比,琥珀酸脫氫酶活力均顯著降低(P＜0.05)。

表1 雙氫青蒿素作用對(duì)嗜熱四膜蟲SOD、GSH-PX、GST、CAT和SDH活力的影響Tab.1 The effect of dihydroartemisinin on enzyme activities in Tetrahymena thermophila (mean±SD,n=3;U/mg Prot)

3 討論

DHA 是青蒿素的衍生物,最先用于治療瘧疾,同時(shí)也具有抗腫瘤、抑菌殺蟲和免疫調(diào)節(jié)的功用。關(guān)于DHA抗寄生蟲作用的研究,發(fā)現(xiàn)DHA通過(guò)破壞原蟲表膜-線粒體系統(tǒng)[3]來(lái)抑制伯氏瘧原蟲的生長(zhǎng);通過(guò)對(duì)毛蟲滋養(yǎng)體的蛋白質(zhì)及細(xì)胞骨架的損傷作用,來(lái)抑制藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的生長(zhǎng)[4];此外DHA 能破壞卡氏肺孢子蟲滋養(yǎng)體和包囊[5]、蟲膜系結(jié)構(gòu)[6]而起到殺蟲作用。伴隨抗寄生蟲藥物耐藥性挑戰(zhàn),雙氫青蒿素有望成為抗寄生蟲新藥,但其殺蟲機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。因此我們采用能體外培養(yǎng)的嗜熱四膜蟲來(lái)研究雙氫青蒿素的抗蟲作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)首先觀察雙氫青蒿素對(duì)嗜熱四膜蟲增殖和形態(tài)的影響,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,DHA作用下細(xì)胞增殖受到抑制,細(xì)胞形態(tài)改變且運(yùn)動(dòng)速度減慢。研究表明青蒿琥脂、雙氫青蒿素對(duì)嗜熱四膜蟲生長(zhǎng)代謝有抑制作用,但雙氫青蒿素的抑制作用強(qiáng)于青蒿琥脂[18],這可能與兩者的構(gòu)效不同有關(guān)。

當(dāng)生物體暴露于外界毒物時(shí),抗氧化防御系統(tǒng)會(huì)構(gòu)成機(jī)體的第一道防線,抗氧化酶活力的改變可反映機(jī)體的氧化應(yīng)激水平。關(guān)于外源化學(xué)物質(zhì)對(duì)嗜熱四膜蟲生物脅迫作用的研究顯示,H2O2處理后細(xì)胞線粒體膜電位喪失,發(fā)生凋亡樣死亡[19]。有機(jī)紫外防曬劑[20]和納米材料[21]均可誘導(dǎo)嗜熱四膜蟲產(chǎn)生氧化應(yīng)激,導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)如SOD和GST等活力降低。在本研究中,DHA在40、80和160 μmol/L濃度下誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶升高,說(shuō)明嗜熱四膜蟲表現(xiàn)出氧化應(yīng)激。隨著DHA濃度升高至320 μmol/L,抗氧化酶水平降低。推測(cè)中低濃度DHA暴露下機(jī)體抗氧化防御酶活性增強(qiáng)以減輕DHA對(duì)細(xì)胞造成的氧化脅迫,而高濃度DHA暴露下細(xì)胞內(nèi)氧化損傷加重導(dǎo)致細(xì)胞活力降低,進(jìn)而破壞抗氧化酶導(dǎo)致酶水平降低。Ye等[12]研究發(fā)現(xiàn),高濃度鉤吻素子(中藥斷腸草中的活性成分)作用嗜熱四膜蟲可引起氧化應(yīng)激和凋亡,低濃度下脅迫作用不明顯。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定差異,不同化學(xué)物質(zhì)對(duì)嗜熱四膜蟲的毒性大小有所區(qū)別,因此細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的適應(yīng)性響應(yīng)不同。

線粒體膜電位的穩(wěn)定有利于維持細(xì)胞的正常生理功能[22]。有研究表明青蒿素在快速殺滅寄生蟲過(guò)程中線粒體膜電位下降是主要生理事件,而膜電位下降又與氧化應(yīng)激催化生成的活性氧(ROS)有關(guān)[23]。琥珀酸脫氫酶參與線粒體能量代謝,是反映線粒體功能的標(biāo)志酶[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,一定濃度的DHA(160和320 μmol/L)暴露可降低嗜熱四膜蟲線粒體膜電位和琥珀酸脫氫酶活力(P＜0.05),這表明DHA暴露可造成線粒體功能損傷。在神經(jīng)元細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)線粒體跨膜電位下降是蒿甲醚引起神經(jīng)毒性的重要環(huán)節(jié)[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究有相似之處,青蒿素類藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用可能與線粒體損傷有關(guān)[26]。結(jié)合Hoechst染色結(jié)果,包括細(xì)胞核出現(xiàn)濃縮和染色體凝集等典型凋亡形態(tài)學(xué)改變,故推測(cè)DHA暴露導(dǎo)致氧化應(yīng)激,引起活性氧過(guò)度堆積,造成線粒體損傷,最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而考慮到線粒體通路產(chǎn)生復(fù)雜的細(xì)胞傳導(dǎo)通路和級(jí)聯(lián)反應(yīng),雙氫青蒿素抗嗜熱四膜蟲的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究現(xiàn)有結(jié)果表明DHA對(duì)嗜熱四膜蟲具有毒性效應(yīng),氧化應(yīng)激和線粒體損傷可能是毒性作用途徑。