高天翔 陳治 王曉艷 張浩博 史會(huì)來(lái)

(1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,舟山 316022;2.海南熱帶海洋學(xué)院水產(chǎn)與生命學(xué)院,三亞 572022;3.浙江海洋大學(xué)國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,舟山 316022;4.浙江省海洋水產(chǎn)研究所,浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,舟山 316021)

褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)屬鲉形目(Scorpaeniformes)、平鲉科(Sebastiae)、菖鲉屬(Sebastiscus)。褐菖鲉作為暖水性底層魚(yú)類,生活在近海底層巖礁地帶,廣泛分布于我國(guó)南北沿海近海巖礁海域,是典型的島礁定居性魚(yú)類[1]。春夏季分散在巖礁岸邊和島嶼四周覓食,冬季游向較深海區(qū)越冬。褐菖鲉是舟山島礁水域的優(yōu)勢(shì)魚(yú)種,同時(shí)也是主要的海洋捕撈及海釣對(duì)象[2,3],具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

環(huán)境DNA(Environmental DNA,eDNA)是生物體釋放于冰芯、土壤、空氣、水體、底泥等環(huán)境中的DNA總稱。eDNA分析是一種從環(huán)境樣品中提取所有的DNA片段,然后通過(guò)相應(yīng)的DNA檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行目標(biāo)生物的定性和定量分析的新工具[4—10]。該方法最早出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代[11],主要被應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究[12—14]。近十年來(lái),隨著樣品采集、DNA提取和DNA測(cè)序分析等關(guān)鍵技術(shù)的突破,環(huán)境DNA分析技術(shù)日漸成熟。其應(yīng)用從微生物分析擴(kuò)展到高等水生或半水生物種鑒定乃至生物群落的多樣性分析,目前已在生物入侵防治、瀕危物種保護(hù)、生物多樣性評(píng)價(jià)及重要資源監(jiān)測(cè)評(píng)估等方面發(fā)揮重要作用[15—17]。

褐菖鲉的研究主要集中在早期發(fā)育、苗種生產(chǎn)及生物學(xué)特征、生理生化及遺傳學(xué)方面[18—24]。國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)褐菖鲉eDNA方面的研究報(bào)道。本文通過(guò)設(shè)計(jì)褐菖鲉特異性引物及Tanqman探針,進(jìn)而建立褐菖鲉養(yǎng)殖密度與其eDNA濃度之間的相關(guān)關(guān)系,為基于eDNA技術(shù)的褐菖鲉生物量評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 褐菖鲉選取

實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2020年6月8日至2020年6月25日,在浙江省舟山市西軒島(29°53′41.45″ N,122°18′40.12″ E)養(yǎng)殖場(chǎng)開(kāi)展研究。由于褐菖鲉個(gè)體暴露在空氣中掙扎強(qiáng)烈,影響體長(zhǎng)、體重等生物學(xué)測(cè)定,因此先目測(cè)挑選個(gè)體基本一致的褐菖鲉個(gè)體,用直徑20 cm、孔徑0.2 cm、柄長(zhǎng)1 m的魚(yú)撈將褐菖鲉撈入直徑1 m、水深10 cm的圓形水槽中。隨后用直徑10 cm、孔徑0.2 cm、把柄長(zhǎng)28 cm的小型魚(yú)撈移入圓形水槽中,對(duì)個(gè)體略大和略小的個(gè)體進(jìn)行再次篩選,以保證圓形水槽中剩余的褐菖鲉個(gè)體大小相近。隨機(jī)采集褐菖鲉個(gè)體,放入20 cm×20 cm×10 cm的塑料泡沫箱中(塑料泡沫箱中事先加入一定體積的水,防止褐菖鲉在泡沫箱中跳動(dòng),影響測(cè)重的準(zhǔn)確性)。用量程為5 kg的天平秤量褐菖鲉的總重,取均值作為每尾實(shí)驗(yàn)魚(yú)的重量。

1.2 室內(nèi)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)

取5個(gè)容積為1 m3、具有完備和相同換水裝置的圓形水桶,用10%次氯酸鈉充分消毒后,在水桶中加入0.5 m3海水(海水已進(jìn)行多級(jí)沉淀、過(guò)濾和消毒)。每個(gè)水桶內(nèi)的水體更新速度恒定保持為3 L/min,多余水體從溢流管流出,使體積保持不變,直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。分別在這5個(gè)水桶中加入2、4、8、16和32尾均重為12.46 g的褐菖鲉,在充分供氧條件下,統(tǒng)一喂食一定數(shù)量的蝦。在加入褐菖鲉0、8h、16h、1d、1.5d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d及10d后,對(duì)每個(gè)水桶采集250 mL水樣,共取平行樣3組,同時(shí)取250 mL純凈水作為空白對(duì)照組。采樣前用濃度為0.1%的次氯酸鈉溶液對(duì)采樣的玻璃瓶進(jìn)行消毒處理。室內(nèi)溫度穩(wěn)定保持在(26±2)℃,保證養(yǎng)殖環(huán)境的穩(wěn)定適宜。

1.3 室外養(yǎng)殖試驗(yàn)

對(duì)3個(gè)室外養(yǎng)殖池[水體體積約為:40 m(長(zhǎng))×15 m(寬)×0.3 m(高)=180 m3]進(jìn)行充分消毒,分別在3個(gè)養(yǎng)殖池內(nèi)投放20、40和80尾褐菖鲉。分別抽取放入褐菖鲉0、8h、16h、1d、1.5d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d及10d后的養(yǎng)殖池水樣2L,共取3組平行樣,空白對(duì)照及消毒方式與室內(nèi)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)相同。

1.4 DNA 提取及 PCR擴(kuò)增驗(yàn)證

采用苯酚-氯仿方法從褐菖鲉肌肉中提取DNA[25]。使用硬骨魚(yú)類COI通用引物F1(5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′)、R1(5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′)[26]進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:DNTPs 2 μL(2.5 μmol/L),10×buffer(含Mg2+)2.5 μL,rTaq0.15 μL(5 U/μL),上下游引物各1 μL(10 μmol/L),DNA模板1 μL(50 ng),無(wú)菌水補(bǔ)齊總體積至25 μL。反應(yīng)程序:95℃ 預(yù)變性5min;40次循環(huán)過(guò)程為：95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,最終在72℃延伸10min后于4℃保存。PCR產(chǎn)物質(zhì)量采用1%瓊脂糖凝膠電泳法來(lái)檢測(cè),使用DL DNA Marker (TaKaRa),挑選電泳條帶單一且最為明亮的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)得的序列使用SeqMan軟件進(jìn)行拼接、比對(duì)及人工手動(dòng)校對(duì),得到褐菖鲉的標(biāo)準(zhǔn)COⅠ片段。

1.5 褐菖鲉特異性引物和Taqman探針設(shè)計(jì)

用Clustal(version 2.0.11)、DNAMAN、Primer-Express 3.0.1及NCBI在線引物設(shè)計(jì)工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/),通過(guò)對(duì)比褐菖鲉與其他5種舟山海域出現(xiàn)的近緣?mèng)~種:許氏平鲉(Sebastes schlegelii)、三色菖鲉(Sebastiscus tertius)、裸胸鲉(Scorpaena izensis)、單指虎鲉(Minous monodactylus)和日本鬼鲉(Inimicus japonicus)的COⅠ基因片段序列,設(shè)計(jì)褐菖鲉特異性引物和TaqMan探針?；谠O(shè)計(jì)好的引物與探針使用K2P模型構(gòu)建NJ樹(shù)計(jì)算褐菖鲉與其他5種近緣?mèng)~種的種間遺傳距離。各魚(yú)種信息見(jiàn)表 1。

表1 褐菖鲉及其近緣種樣品信息Tab.1 Sampling information of S.marmoratus and its relative species

1.6 特異性引物和TaqMan探針的驗(yàn)證

使用普通P C R 驗(yàn)證引物的可行性,并用7300Plus Real-Time PCR儀檢測(cè)引物和探針的特異性。熒光定量PCR擴(kuò)增體系為:TaqMan? Fast qPCR Master Mix(Applied Biosystems?) 10 μL、正反向引物各0.4 μL (10 μmol/L)、DNA模板2 μL (50 ng)、探針0.4 μL (10 μmol/L)、無(wú)菌水補(bǔ)齊至20 μL。熱循環(huán)條件:50℃孵育2 min進(jìn)行UNG酶激活,95℃預(yù)變性2min,45次循環(huán)過(guò)程為95℃變性30s,60℃退火/延伸30s。驗(yàn)證用到的魚(yú)種見(jiàn)表 1。

1.7 褐菖鲉eDNA 提取及數(shù)字定量PCR擴(kuò)增

對(duì)1.2和1.3采集的250 mL和2 L水用直徑47 mm,孔徑0.45 μm的醋酸纖維素濾膜(上海興亞)抽濾,分別抽濾等體積的純凈水作為陰性對(duì)照。用DNeasy Blood and Tissue Kit試劑盒進(jìn)行eDNA提取,使用QuantStudio 3D數(shù)字PCR(Digital PCR,dPCR)進(jìn)行褐菖鲉eDNA濃度的測(cè)定。

1.8 eDNA 濃度計(jì)算

使用R軟件(version 4.0.3)“basicTrendline”包對(duì)不同分組間進(jìn)行散點(diǎn)圖擬合,計(jì)算線性回歸方程、方差和相關(guān)系數(shù),同時(shí)進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)。使用Excel 2019繪制褐菖鲉eDNA濃度變化趨勢(shì)圖及生物量加倍時(shí)eDNA濃度的增長(zhǎng)倍數(shù)雷達(dá)圖。

2 結(jié)果

2.1 褐菖鲉特異性引物和探針

通過(guò)比對(duì)褐菖鲉與其他5種近緣?mèng)~種COⅠ基因片段序列,設(shè)計(jì)的褐菖鲉特異性引物和探針位于褐菖鲉線粒體基因組6503—6575 bp,其中引物為:HF-6503:5′-ATTACCGCTGTCCTTCTCCTT-3′、HR-6575:5′-ACAATGCTTCTAACAGACCGGAA-3′,探針為:HPro-6524:FAM-TCTCCCTACCAG TTCTTGCTGCTGGCAT-TAMRA。褐菖鲉的引物、探針序列及與近緣?mèng)~種的堿基差異情況如圖 1所示,種間遺傳距離見(jiàn)表 2。

表2 褐菖鲉特異性引物、探針信息Tab.2 Information of specific primers and probe of S.marmoratus

圖1 褐菖鲉引物、探針序列與其近緣種堿基差異情況Fig.1 Nucleotide variation of primers and probe between S.marmoratus and its relative species

2.2 熒光定量PCR結(jié)果

以6種魚(yú)類的組織DNA為模板,進(jìn)行引物探針的特異性驗(yàn)證,結(jié)果顯示褐菖鲉的Ct值為20左右,其他5個(gè)近緣?mèng)~種均未檢出。由此證明設(shè)計(jì)的褐菖鲉引物和探針具有特異性。各物種qPCR所得的Ct值見(jiàn)表 3。

表3 基于熒光定量PCR的目標(biāo)生物引物、探針特異性驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 The specificity of primers and probe of target species by qPCR

2.3 室內(nèi)養(yǎng)殖條件下褐菖鲉eDNA濃度變化情況

室內(nèi)養(yǎng)殖條件下褐菖鲉eDNA濃度具體變化趨勢(shì)見(jiàn)圖 2。褐菖鲉eDNA濃度前后變化明顯,48h后達(dá)到峰值,3d后較為穩(wěn)定,且與各自群體密度相對(duì)應(yīng)。

圖2 室內(nèi)水體褐菖鲉eDNA濃度變化情況Fig.2 Variation trend of eDNA concentration of S.marmoratus in indoor tanks

2.4 室外養(yǎng)殖條件下褐菖鲉eDNA濃度變化情況

室內(nèi)養(yǎng)殖條件下eDNA濃度具體變化趨勢(shì)見(jiàn)圖 3。eDNA濃度先減少,存在8h的檢測(cè)盲點(diǎn),之后再次增加,72h后達(dá)到峰值。

圖3 室內(nèi)水體褐菖鲉eDNA濃度變化情況Fig.3 Variation trend of eDNA concentrations of S.marmoratus in outdoor ponds

2.5 室內(nèi)養(yǎng)殖條件下褐菖鲉eDNA濃度與其養(yǎng)殖密度之間的相關(guān)關(guān)系

將同一養(yǎng)殖密度下不同時(shí)間的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合,評(píng)估養(yǎng)殖密度與eDNA濃度之間的整體相關(guān)性(圖4a),擬合效果較差,相關(guān)性不高(R2=0.70)。因此將時(shí)間組分為釋放早期:0—4d(含前者不含后者)和穩(wěn)定期:4—10d(含這兩個(gè)點(diǎn))兩個(gè)時(shí)間段,取兩個(gè)時(shí)間段內(nèi)的分子拷貝數(shù)分別進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示穩(wěn)定期的擬合效果更佳(圖4b),在該時(shí)間段內(nèi),室內(nèi)養(yǎng)殖條件下eDNA濃度與褐菖鲉養(yǎng)殖密度之間呈顯著的線性相關(guān),關(guān)系式為:Density (ind./m3)=6.094×10-5×eDNA concentrations (copies/L)-1.033,R2=0.96。

圖4 室內(nèi)養(yǎng)殖條件下褐菖鲉eDNA與其養(yǎng)殖密度之間相關(guān)關(guān)系Fig.4 Correlation between eDNA of S.marmoratus and its culture density in indoor culture

2.6 室外養(yǎng)殖條件下褐菖鲉eDNA濃度與其養(yǎng)殖密度之間的相關(guān)關(guān)系

室外數(shù)據(jù)整合與室內(nèi)數(shù)據(jù)方法一致,對(duì)養(yǎng)殖密度與eDNA濃度之間的整體相關(guān)性進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果顯示整體擬合效果較差(圖5a),相關(guān)性較低(R2=0.17)。同樣將時(shí)間組分為釋放早期:0—7d(含前者不含后者)和穩(wěn)定期:7—10d(含這兩個(gè)點(diǎn))兩個(gè)時(shí)間段,取兩個(gè)時(shí)間段內(nèi)的分子拷貝數(shù)分別進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示穩(wěn)定期的擬合效果更佳(圖5b),在該時(shí)間段內(nèi),室外養(yǎng)殖條件下eDNA濃度與褐菖鲉養(yǎng)殖密度之間呈顯著的線性相關(guān),關(guān)系式為:關(guān)系式為:Density (ind./m3)=2.445×10-4× eDNA concentrations (copies/L)-0.123,R2=0.99。

圖5 室外養(yǎng)殖條件下褐菖鲉eDNA濃度與其養(yǎng)殖密度之間相關(guān)關(guān)系Fig.5 Correlation between eDNA of S.marmoratus and its culture density in outdoor culture

2.7 室內(nèi)、室外養(yǎng)殖條件下,eDNA濃度與褐菖鲉養(yǎng)殖密度之間關(guān)系的聯(lián)合分析

將室內(nèi)水桶和室外養(yǎng)殖池實(shí)驗(yàn)結(jié)果聯(lián)合,進(jìn)行eDNA濃度與褐菖鲉養(yǎng)殖密度相關(guān)關(guān)系分析。結(jié)果表明整體與釋放早期擬合效果差、相關(guān)性低(圖6a),室內(nèi)室外在穩(wěn)定期的數(shù)據(jù)表明eDNA濃度與褐菖鲉養(yǎng)殖密度之間呈線性相關(guān)關(guān)系(圖6b),關(guān)系式為:Density (ind./m3)=6.017×10-5× eDNA concentrations (copies/L) -0.485,R2=0.96。

2.8 褐菖鲉生物量加倍時(shí) eDNA濃度的增長(zhǎng)倍數(shù)

選取室內(nèi)組、室外組穩(wěn)定期數(shù)據(jù)探究褐菖鲉養(yǎng)殖密度加倍時(shí)eDNA濃度增長(zhǎng)倍數(shù)(表4和表 5)。室內(nèi)組在養(yǎng)殖密度由8 ind./m3增加到16 ind./m3時(shí),eDNA濃度增長(zhǎng)倍數(shù)較高,室外組養(yǎng)殖密度由0.22 ind./m3增加到0.44 ind./m3時(shí),eDNA濃度增長(zhǎng)倍數(shù)高。整體來(lái)看,室內(nèi)各小組eDNA濃度增長(zhǎng)倍數(shù)(圖7)均高于室外小組(圖8),室內(nèi)組和室外組中eDNA濃度隨著褐菖鲉養(yǎng)殖密度增加而增加,但室內(nèi)組隨著養(yǎng)殖密度不斷增加eDNA濃度增加倍數(shù)趨于平緩。

圖7 室內(nèi)褐菖鲉養(yǎng)殖密度加倍時(shí)eDNA濃度增長(zhǎng)倍數(shù)Fig.7 Ratio of indoor eDNA growth of S.marmoratus resulted from its culture density doubling

圖8 室外水體褐菖鲉養(yǎng)殖密度加倍時(shí)eDNA濃度增長(zhǎng)倍數(shù)Fig.8 Ratio of outdoor eDNA growth of S.marmoratus resulted from its culture density doubling

表4 室內(nèi)褐菖鲉養(yǎng)殖密度加倍時(shí)eDNA濃度增長(zhǎng)倍數(shù)Tab.4 Ratio of indoor eDNA growth of S.marmoratus resulted from its culture density doubling

表5 室外水體褐菖鲉養(yǎng)殖密度加倍時(shí)其eDNA濃度增長(zhǎng)倍數(shù)Tab.5 Ratio of outdoor eDNA growth of S.marmoratus resulted from its culture density doubling

a.整體與釋放早期;b.穩(wěn)定期a.whole and early stage of release;b.stable stage

3 討論

3.1 特異性引物和探針設(shè)計(jì)

TaqMan探針?lè)軌虮ＷC在擴(kuò)增過(guò)程中只對(duì)目標(biāo)種進(jìn)行特異性檢測(cè)[27,28]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)褐菖鲉及其近緣?mèng)~種進(jìn)行同源序列比對(duì),在序列變異較大的位置進(jìn)行特異性引物探針設(shè)計(jì),所得的引物、探針與近緣?mèng)~種序列皆存在一定數(shù)量的堿基差異。在引物探針的特異性驗(yàn)證過(guò)程中,僅以褐菖鲉組織DNA為模板的樣品被檢測(cè)出,而以其他5種近緣?mèng)~種組織DNA為模板的樣品均未檢出,因此本研究設(shè)計(jì)的褐菖鲉特異性引物和TaqMan探針能保證擴(kuò)增結(jié)果的特異性。

3.2 褐菖鲉eDNA定量檢測(cè)技術(shù)的高靈敏性

室內(nèi)條件下,不同養(yǎng)殖密度檢測(cè)到的eDNA在0—2d時(shí)間段內(nèi)呈上升趨勢(shì),在2—3d內(nèi)褐菖鲉eDNA濃度回落,3d后趨于穩(wěn)定狀態(tài)。在室外條件下,0—1d、1d—3d和3d—10d這3個(gè)時(shí)間段內(nèi),褐菖鲉eDNA濃度分別呈下降,上升和穩(wěn)定趨勢(shì)。室內(nèi)水桶及室外養(yǎng)殖池在“0”組的eDNA濃度極低,但并不為0。這與水母(Chrysaora pacifica)、鯉(Hypophthalmichthys molitrix)等物種定量檢測(cè)研究結(jié)果相一致[15,29]。塑料魚(yú)籠放入水桶的瞬間可能引起了水流波動(dòng),導(dǎo)致褐菖鲉eDNA能夠擴(kuò)散到臨近水體中,致使dPCR結(jié)果為陽(yáng)性。本實(shí)驗(yàn)選用的褐菖鲉全部為幼魚(yú),個(gè)體都比較小(12.46 g/尾);室外養(yǎng)殖池的水體體積也較大,最低密度組(0.11 ind./m3)中的褐菖鲉eDNA在釋放早期仍可被dPCR檢出。在不同時(shí)間段室內(nèi)組和室外組檢測(cè)的褐菖鲉eDNA濃度均有所不同,且差異較大,由此可以看出褐菖鲉eDNA定量檢測(cè)技術(shù)具有較高的靈敏性。

3.3 褐菖鲉eDNA濃度變化及“空白的8h”

無(wú)論是室內(nèi)水桶組還是室外養(yǎng)殖池組,褐菖鲉eDNA濃度的波動(dòng)范圍都比較大。穩(wěn)定時(shí)期的褐菖鲉eDNA濃度大約比初始時(shí)期高1—2個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)特定物種進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí),應(yīng)在預(yù)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置不同的采樣時(shí)間點(diǎn),預(yù)先研究水體中eDNA濃度的穩(wěn)定情況。室內(nèi)和室外在實(shí)驗(yàn)前期階段(eDNA釋放早期)的生物量評(píng)估結(jié)果較差,因此用于擬合分析的數(shù)據(jù)應(yīng)選自eDNA穩(wěn)定釋放的時(shí)期,而結(jié)果也表明穩(wěn)定期的線性擬合效果好。在室外養(yǎng)殖組,褐菖鲉初始組(0)的eDNA濃度較高,這可能是因?yàn)槭覂?nèi)、室外水溫不一致,褐菖鲉由室內(nèi)轉(zhuǎn)移室外時(shí)會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),皮膚黏液脫落等原因造成。但在0—1d組,水樣中的褐菖鲉eDNA濃度迅速降低;尤其是16h—1d時(shí)間段出現(xiàn)了eDNA濃度的“空白的8h”,dPCR也無(wú)法檢測(cè)到水體中的褐菖鲉eDNA。室外養(yǎng)殖池水質(zhì)較為清澈,褐菖鲉初始階段為躲避外界刺激可能游向水較深、離岸較遠(yuǎn)的水池中央。褐菖鲉具有明顯的戀礁性[18,30]，靜止在養(yǎng)殖池中部的褐菖鲉可能不再發(fā)生游動(dòng)。取樣處的褐菖鲉eDNA擴(kuò)散或者降解后不再有新的褐菖鲉eDNA補(bǔ)充。反映在dPCR結(jié)果上,則是16h—1d階段內(nèi)褐菖鲉eDNA檢測(cè)為陰性。而1d后,水池中央的褐菖鲉eDNA開(kāi)始擴(kuò)散到養(yǎng)殖池外緣的水樣采集處。褐菖鲉eDNA才得以開(kāi)始累積,直到最后穩(wěn)定下來(lái)。由此來(lái)看,戀礁行為可能會(huì)影響褐菖鲉eDNA擴(kuò)散,“遠(yuǎn)礁點(diǎn)”處存在eDNA檢測(cè)盲點(diǎn)。

此外,采樣點(diǎn)的設(shè)置對(duì)eDNA檢出和濃度估計(jì)是一個(gè)重要的因素。受室外條件限制,室外條件下的養(yǎng)殖池僅設(shè)置了一個(gè)采樣位點(diǎn),這可能會(huì)導(dǎo)致檢出的eDNA濃度與實(shí)際有所偏差。水體eDNA的數(shù)量、質(zhì)量和穩(wěn)定性在很大程度上受到其在水中擴(kuò)散的影響[31—33],室內(nèi)養(yǎng)殖水桶體積小,因此采樣位點(diǎn)對(duì)eDNA檢測(cè)影響較小。室外養(yǎng)殖池范圍較大,由于褐菖鲉的戀礁性會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖池內(nèi)的eDNA分布不均勻,單一采樣位點(diǎn)難以保證采集到池內(nèi)均勻的eDNA,無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估實(shí)際的eDNA濃度[36]。在自然環(huán)境中,水流、溫度、降水和紫外線等因素都會(huì)影響影響eDNA的降解[34—36],從而影響eDNA檢出與濃度估計(jì)。室外的環(huán)境因素往往無(wú)法控制,因此在難以保證養(yǎng)殖條件穩(wěn)定的情況下設(shè)置多個(gè)采樣位點(diǎn)對(duì)于eDNA的檢出和濃度的評(píng)估是非常有必要的。

3.4 在室內(nèi)和室外條件下,褐菖鲉eDNA與其密度相關(guān)關(guān)系

由于eDNA技術(shù)是基于生物體持續(xù)釋放到周?chē)h(huán)境的代謝物來(lái)分析和研究的[37,38]。在本研究中,隨著養(yǎng)殖密度增加,褐菖鲉eDNA濃度也呈增加趨勢(shì),可見(jiàn)養(yǎng)殖條件下的水體eDNA能夠體現(xiàn)褐菖鲉密度,其相關(guān)關(guān)系為近海野外褐菖鲉資源定量監(jiān)測(cè)評(píng)估奠定了基礎(chǔ)。實(shí)際的野外采樣要選擇天氣情況良好且溫度適宜的時(shí)間段,以便采集到褐菖鲉eDNA釋放穩(wěn)定期的水樣,最能反映實(shí)際環(huán)境的褐菖鲉資源密度和數(shù)量。同時(shí)要盡可能增加采樣位點(diǎn)和重復(fù)采樣,避免產(chǎn)生檢測(cè)盲點(diǎn)導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。