陸亦寬，徐迪，劉文悅，郭桂萍，盧瑛*，謝晶

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，上海，201306)4(中華人民共和國南通海關(guān)，江蘇 南通，226000)

據(jù)《2020中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì)顯示, 我國2019年水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)6 480.36萬t, 水產(chǎn)行業(yè)持續(xù)蓬勃發(fā)展[1]。然而水產(chǎn)品的安全問題卻屢見不鮮，目前水產(chǎn)品不合格的主要原因90%集中于獸藥殘留和重金屬超標(biāo)，獸藥殘留主要有硝基呋喃類、氯霉素類、孔雀石綠等[2-3]，給我國消費(fèi)者的健康造成了嚴(yán)重危害。近年來，新興獸藥漁用麻醉劑因其價(jià)格低廉、使用方便、可以有效降低水產(chǎn)品在運(yùn)輸過程中產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[5-7]，越來越多的應(yīng)用于活魚運(yùn)輸過程中，構(gòu)成了潛在的危害[8-10]。

目前，獸藥殘留和漁用麻醉劑的檢測方法多為儀器分析方法[11]，例如氣質(zhì)聯(lián)用法[12-14]、液質(zhì)聯(lián)用法[15-20]等，其樣品前處理存在操作繁瑣、耗時(shí)長、試劑消耗大、需要專業(yè)設(shè)備輔助處理等問題。例如LI等[13]采用10 mL乙腈，經(jīng)冷凍離心、低溫冷凍、氮吹耗時(shí)4 h以上制備魚肉中的三卡因待測樣品；XIE等[18]制備魚肉中的孔雀石綠待測樣品，需采用50 mL乙腈，經(jīng)高速離心、氮吹等前處理耗時(shí)3.5 h。

當(dāng)前對前處理的優(yōu)化主要集中在提取和凈化兩方面。提取方面，傳統(tǒng)的液-液萃取法雖易于實(shí)現(xiàn)，但存在試劑用量大的缺陷[12,19-20]，新興的分散液-液微萃取技術(shù)則在此基礎(chǔ)上顯著地降低了試劑消耗問題，提取試劑用量從mL級別降低到了μL級別，并已成功應(yīng)用于果蔬、牛奶等樣品的檢測[21]。凈化方面，傳統(tǒng)凈化主要采用固相萃取柱消除基質(zhì)干擾，簡化研究主要集中在優(yōu)化萃取柱使用流程或采用其他簡便、效果相當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行凈化處理。如高平等[19]采用通過式固相萃取柱檢測水產(chǎn)品中的漁用麻醉劑殘留，免去了傳統(tǒng)步驟中活化、淋洗、洗脫等步驟，且可以通過重力自然通過小柱而無需固相萃取裝置；LI等[17]通過改良QuEChERS法檢測魚肉組織中的三卡因，通過優(yōu)化提取劑、改變凈化劑組成，處理時(shí)間在30 min內(nèi)，回收率可達(dá)79.6%～119.7%。盡管目前樣品前處理技術(shù)有了一定的發(fā)展，但仍存在依賴專業(yè)設(shè)備輔助、需專業(yè)人員操作及應(yīng)用范圍窄等問題。

本研究首先通過優(yōu)化流動(dòng)相、檢測波長等條件建立了三卡因的HPLC檢測方法，并應(yīng)用在其他5種漁用麻醉劑的檢測上。隨后通過減少樣品及提取試劑用量、降低前處理凈化濃縮所需設(shè)備條件等途徑建立了快速前處理工藝，再通過提取試劑用量、渦旋混合時(shí)間和凈化劑用量的單因素優(yōu)化，綜合6種漁用麻醉劑的人工模擬樣品檢測和回收率評價(jià)，建立了一種適用于三卡因、2-苯氧乙醇、丙泊酚、丁香酚、乙酸丁香酚酯、苯佐卡因6種漁用麻醉劑檢測的快速前處理方法。最后采用對加標(biāo)樣品和模擬麻醉運(yùn)輸大菱鲆的三卡因殘留樣品，通過HPLC和試紙條檢測的應(yīng)用，探討了該前處理方法的適用性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

三卡因(純度99.9%)，德國Dr公司；丁香酚(純度99.9%)，德國Sigma公司；苯佐卡因(純度98%)、2-苯氧乙醇(純度98%)、乙酸丁香酚酯(純度>98%)、丙泊酚(純度98%)，上海源葉生物公司；乙腈、乙酸銨，均為HPLC級，上海麥克林生化科技有限公司；凈化劑(50% MgSO4、20%乙二胺-N-丙基硅烷、20% C18、10%石墨碳)，深圳逗點(diǎn)生物有限公司。

Agilent Infinity 1260高效液相色譜儀及Agilent OpenLAB Control Panel 2010數(shù)據(jù)處理軟件；渦旋振蕩器，美國奧然科技公司；掌式離心機(jī)，美國賽洛捷克公司；恒溫水浴鍋，上海藍(lán)豹實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；純水儀，德國默克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：分別精確稱取100.0 mg的三卡因、丁香酚、2-苯氧乙醇、苯佐卡因、乙酸丁香酚酯、丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制為10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.2.2 樣品前處理方法

經(jīng)典前處理方法：通過手動(dòng)斬拌機(jī)斬拌魚肉，稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈和均質(zhì)子，渦旋振蕩30 s后，超聲10 min，在4 000 r/min條件下離心5 min，移取上層液體至活化后C18固相萃取柱，使用甲醇洗脫并收集2 mL洗脫液于10 mL離心管中，隨后在40 ℃下氮吹至近干，用1 mL乙腈復(fù)溶，過0.22 μm 有機(jī)相膜后待HPLC分析。

簡化前處理方法：通過手動(dòng)斬拌機(jī)斬拌魚肉，稱取1.0 g樣品于15 mL離心管中，加入1.5 mL乙腈和均質(zhì)子，渦旋振蕩2.5 min后，分別移取上層液體1 mL 至含有150 mg的4種常用凈化劑(75 mg MgSO4、30 mg乙二胺-N-丙基硅烷、30 mg C18、15 mg石墨碳)的2 mL離心管中，渦旋振蕩2 min后，于掌式離心機(jī)離心2 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)相膜后待HPLC分析；隨后取500 μL樣品液于2 mL離心管置于50 ℃水浴鍋中，用真空泵吹干后用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后，待試紙條檢測。

1.2.3 HPLC分析參數(shù)的設(shè)置

采用DIKMA Diaminsil Plus C18-A柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水，以V(乙腈)∶V(水)=7∶3的比例等度洗脫，流速0.6 mL/min，在220 nm下檢測三卡因、丁香酚；在280 nm下檢測苯佐卡因、乙酸丁香酚酯、丙泊酚和2-苯氧乙醇；柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 三卡因HPLC檢測方法的建立

流動(dòng)相的選擇：配制濃度為1、5、10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，比較流動(dòng)相組合為乙腈和水、乙腈和乙酸銨、乙腈和0.1%甲酸水(體積比)、甲醇和水、甲醇和 0.1%甲酸水的條件下三卡因響應(yīng)值的大小。

檢測波長的選擇：配制質(zhì)量濃度為1、5、10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，比較檢測波長為200、210、220、230、240 nm 的條件下三卡因響應(yīng)值的大小。

1.2.5 三卡因快速前處理工藝的建立

1.2.5.1 快速前處理工藝的建立

采用烏鱧基質(zhì)為加標(biāo)樣品進(jìn)行前處理工藝優(yōu)化，三卡因加標(biāo)濃度為0.1、1、5 mg/kg。

稱樣量的優(yōu)化：采用1.2.2中經(jīng)典方法處理樣品，通過HPLC檢測，比較稱樣量1 g和5 g時(shí)回收率的差異。

提取和凈化濃縮流程的簡化：采用1.2.2中經(jīng)典方法處理樣品，并改變提取和凈化濃縮流程，通過HPLC檢測，比較兩者回收率的差異。

1.2.5.2 快速前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

采用烏鱧基質(zhì)為加標(biāo)樣品進(jìn)行前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，三卡因加標(biāo)濃度為0.1、1、5 mg/kg。

提取劑乙腈添加量的優(yōu)化：按1.2.2中簡化方法處理樣品，通過HPLC檢測，比較乙腈添加量為1、1.5、2 mL時(shí)回收率的差異。

渦旋混合時(shí)間的優(yōu)化：按1.2.2中簡化方法理處理樣品，通過HPLC檢測，比較渦旋混合時(shí)間為1.5、2、2.5、3 min時(shí)回收率的差異。

凈化劑用量的優(yōu)化：按1.2.2中簡化方法處理樣品，通過HPLC檢測，比較凈化劑用量為100、150、200 mg 時(shí)回收率的差異。

1.2.6 三卡因的快檢試紙條檢測

烏鱧樣品采用1.2.2中簡化方法前處理，三卡因免疫層析試紙條為實(shí)驗(yàn)室前期研制。檢測方法如下：將4 μL磁納米探針與100 μL樣本混合后，振蕩超聲30 s，隨后加入16 μL層析液[含5%(體積分?jǐn)?shù))吐溫-20]、0.2～0.3 g/mL牛血清蛋白的磷酸鹽緩沖溶液)，振蕩超聲30 s，將上述混合液滴加至試紙條樣品墊上，層析反應(yīng)后進(jìn)行肉眼判斷定性，磁信號儀精確定量。

1.2.7 漁用麻醉劑的前處理樣品制備與檢測

采用1.2.2中簡化方法前處理加標(biāo)水平為0.5、5、10 mg/kg的烏鱧、海鱸魚和南美白對蝦樣品，加標(biāo)漁用麻醉劑為三卡因、丁香酚、2-苯氧乙醇、苯佐卡因、乙酸丁香酚酯和丙泊酚，通過HPLC進(jìn)行檢測，評價(jià)回收率。回收率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 漁用麻醉劑的HPLC檢測方法的建立

本研究通過優(yōu)化檢測波長和流動(dòng)相組成建立三卡因HPLC檢測方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示。檢測波長方面，結(jié)果如圖1-A所示，可以看到各個(gè)濃度下響應(yīng)值從200 nm到220 nm漸漸上升，從220 nm之后響應(yīng)值就開始下降，故而選擇220 nm為最佳檢測波長。流動(dòng)相的優(yōu)化結(jié)果如圖1-B所示，可以看到在三卡因低質(zhì)量濃度1 μg/mL時(shí)，各類流動(dòng)相的響應(yīng)值相近，隨著濃度達(dá)5和10 μg/mL時(shí)，響應(yīng)值差距拉大，乙腈-甲酸水和甲醇-甲酸水效果較差，乙腈-乙酸銨、乙腈-水和甲醇-水的響應(yīng)值較好且相近，由于乙酸銨作為鹽類會對色譜系統(tǒng)有一定的影響，因而進(jìn)一步地對這乙腈-水和甲醇-水兩組的柱效和拖尾因子進(jìn)行評價(jià)。

柱效和拖尾因子體現(xiàn)了色譜峰的峰形好壞，影響著檢測結(jié)果準(zhǔn)確與否。如圖1-C、圖1-D所示，在拖尾因子方面，乙腈-水和甲醇-水效果基本相當(dāng)，說明色譜峰峰形較尖銳；而在柱效方面，乙腈-水的柱效明顯高于甲醇-水，說明有著更好的色譜峰性能，故而最后選擇乙腈-水為流動(dòng)相。

其他漁用麻醉劑在三卡因優(yōu)化后的檢測條件下進(jìn)行檢測，除丁香酚外，其他漁用麻醉劑檢測波長有所調(diào)整，在280 nm檢測波長下檢測苯佐卡因、乙酸丁香酚酯、丙泊酚和2-苯氧乙醇。

表1 線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限與定量限Table 1 Linear equation, correlation coefficient, limit of detection and limit of quantification

A-三卡因檢測波長的選擇；B-三卡因檢測流動(dòng)相的選擇；C-乙腈-水與甲醇-水柱效的比較；D-乙腈-水與甲醇-水的拖尾因子比較圖1 三卡因HPLC檢測優(yōu)化條件及漁用麻醉劑色譜圖Fig.1 Optimization of HPLC detection conditions of tricaine and chromatogram of fishery anesthetic

2.2 三卡因快速前處理方法的建立

2.2.1 烏鱧中三卡因的快速前處理流程簡化

樣品前處理主要包括樣品提取和凈化濃縮2個(gè)步驟，決定了前處理時(shí)間和復(fù)雜程度?；诖?，本文參考多篇文獻(xiàn)建立經(jīng)典前處理方法，樣品提取參考LI等[17]、XIE等[18]提取方法，采用乙腈作為提取劑，稱樣量5 g；凈化流程參考了HUANG等[22]、高平等[19]凈化方法，采用固相萃取柱凈化和氮吹濃縮。本研究主要針對樣品提取和凈化濃縮的流程進(jìn)行了簡化，降低了處理難度和所需時(shí)間，主要改變?nèi)鐖D2所示。

傳統(tǒng)獸藥前處理技術(shù)通常采用10 mL以上的提取試劑，這就導(dǎo)致后續(xù)操作需要大型離心機(jī)輔助以及更長的凈化濃縮耗時(shí)，例如固相萃取柱的過柱時(shí)間延長，氮吹儀的氮吹時(shí)間延長，這些因素疊加在一起致使樣品前處理時(shí)間變長、成本增加。本研究首先針對樣品提取流程進(jìn)行優(yōu)化，主要包括樣品用量的減少和所需設(shè)備條件的簡化，將樣品用量降低至1 g，以便使用更少的提取試劑1.5 mL，使得后續(xù)操作可在2 mL離心管中使用，實(shí)現(xiàn)了便攜掌式離心機(jī)代替了大型離心機(jī)的簡化。然后本研究針對樣品的凈化濃縮流程進(jìn)行改良，采用QuEChERS法結(jié)合水浴鍋真空泵有效縮短了凈化濃縮所需時(shí)間，避免了傳統(tǒng)的固相萃取裝置和氮吹儀的使用，更便于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測需求，將凈化耗時(shí)從1.5 h壓縮至10 min內(nèi)。最后，將簡化后的提取和凈化濃縮流程結(jié)合，與經(jīng)典前處理方法對比，驗(yàn)證快速前處理流程簡化的可行性。具體見圖2。

圖2 前處理流程簡化示意圖Fig.2 Diagram of simplified pretreatment process

如圖3所示，可以看到在低中高3個(gè)加標(biāo)濃度下，流程簡化前后三卡因的回收率較為相近。如圖3-A所示，樣品量的變化對于加標(biāo)回收率基本沒有影響，說明降低稱樣量和提取劑用量的思路可行；如圖3-B 和圖3-C所示，將提取流程和凈化流程簡化后，加標(biāo)回收率有所下降，但最大相差不超過5%，說明單純的渦旋振蕩可以代替渦旋與超聲聯(lián)用的提取方式，而水浴結(jié)合真空泵吹干的方式可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)氮吹。圖3-D顯示了在相同加標(biāo)濃度下，傳統(tǒng)前處理流程和簡化前處理流程的回收率相近，且簡化前處理流程的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差雖大于傳統(tǒng)前處理流程，但仍在8%以內(nèi)，說明簡化前處理流程穩(wěn)定性較好，可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)前處理流程。

A-樣品量變化前后三卡因回收率比較；B-提取流程簡化三卡因回收率比較；C-凈化流程簡化三卡因回收率比較；D-傳統(tǒng)前處理與簡化前處理方法比較圖3 傳統(tǒng)前處理流程簡化后的比較Fig.3 Comparison of simplified traditional pretreatment processes

2.2.2 三卡因前處理工藝優(yōu)化

為了減少提取試劑的使用量，對微量提取試劑(1～2 mL)進(jìn)行了優(yōu)化。如圖4-A所示。提取試劑體積為1.5 mL時(shí)在各加標(biāo)濃度下的回收率最佳，而1 mL效果較差，其原因可能是因?yàn)樘崛≡噭┯昧枯^少，致使回收過程中損失較大，王錚等[23]在降低孔雀石綠提取試劑用量也遇到類似問題，過少的提取試劑可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，而2 mL的回收率與1.5 mL相近，這可能是提取試劑飽和所致[15]。

因凈化時(shí)采用的是2 mL離心管，故此凈化劑用量不能太多。如圖4-B所示，當(dāng)商用凈化劑用量為100～300 mg時(shí)，回收率先上升后下降，可能是因?yàn)檩^少的凈化劑凈化效果不佳。 LI等[17]優(yōu)化三卡因前處理時(shí)的研究表明過少的凈化劑會有更明顯的基質(zhì)效應(yīng)，而過度的凈化劑則會導(dǎo)致非特異性吸附，從而使回收率下降；實(shí)驗(yàn)過程中觀察到過多的凈化劑會有結(jié)塊現(xiàn)象，這可能是由于凈化劑中含有MgSO4，該鹽有較好的吸水效果，但吸水后會產(chǎn)生水合硫酸鎂晶體，導(dǎo)致結(jié)塊現(xiàn)象，這與PERESTRELO等[24]描述相近，從而影響了待測物的提取，故而最佳凈化劑用量為150 mg。如圖4-C所示，渦旋時(shí)間小于1.5 min時(shí)回收率在80%以下，回收效果較差；渦旋混合1.5 min 以后回收率逐步趨于穩(wěn)定，在加標(biāo)量為1和5 mg/kg時(shí)，混合2.5和3 min的回收率相近，因此選擇2.5 min為最佳渦旋混合時(shí)間。

綜上，三卡因最佳前處理工藝條件為乙腈用量1.5 mL，凈化劑添加量150 mg，渦旋混合時(shí)間2.5 min。

2.3 三卡因快速前處理方法的應(yīng)用與推廣

2.3.1 快速前處理方法在多種漁用麻醉劑前處理中的應(yīng)用

依據(jù)三卡因優(yōu)化后的樣品前處理?xiàng)l件，對三卡因和其他漁用麻醉劑丁香酚、2-苯氧乙醇、苯佐卡因、乙酸丁香酚酯和丙泊酚進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)樣品為烏鱧、海鱸魚和南美白對蝦。由圖5可知，6種漁用麻醉劑的回收率在0.5、5、10 mg/kg的添加水平下，回收率均在80%以上,說明本法有較好的應(yīng)用性。苯佐卡因在3種基質(zhì)中的回收率與三卡因相近，在0.5、5、10 mg/kg 3個(gè)水平下回收率均在95%以上，這可能是由于苯佐卡因與三卡因結(jié)構(gòu)相近，故而有相近的表現(xiàn)[6]。丁香酚在海鱸魚和烏鱧中的回收率表現(xiàn)類似，均是在0.5、10 mg/kg回收率較高，在5 mg/kg時(shí)回收率較低，而在蝦肉基質(zhì)中則依加標(biāo)量大小回收率依次增加，這可能是由于基質(zhì)效應(yīng)不同所導(dǎo)致的乙酸丁香酚酯和丙泊酚較其他4種漁用麻醉劑整體回收率偏低，尤其在0.5 mg/kg 的加標(biāo)量下，回收率在82.08%～85.76%，這可能是兩者的HPLC定量限較高導(dǎo)致，乙酸丁香酚酯和丙泊酚的定量限分別為0.683 mg/kg和0.414 1 mg/kg，接近0.5 mg/kg，導(dǎo)致其回收率較低，也可能是未采用最佳的提取試劑，據(jù)顏琿璘等[25]報(bào)道丙泊酚最佳提取試劑為乙酸乙酯；而乙酸丁香酚酯相較于其他麻醉劑回收率較低這與翟紋靜等[5]的研究相近。

A-乙腈添加量對于回收率的影響；B-凈化劑用量對于回收率的影響；C-渦旋時(shí)間對比回收率的影響圖4 三卡因前處理?xiàng)l件優(yōu)化Fig.4 Optimization of pretreatment conditions for tricaine

2.3.2 三卡因快速前處理方法在試紙條檢測中的應(yīng)用

為了驗(yàn)證簡化后前處理方法的普適性，以烏鱧為加標(biāo)樣品，制備加標(biāo)水平為 0.5、5、10 mg/kg的加標(biāo)樣品；此外以大菱鲆為模擬麻醉對象，在三卡因質(zhì)量濃度為30 mg/mL的水中模擬運(yùn)輸24 h，每隔6 h取樣1次，樣品為魚肉。所有的樣品經(jīng)簡化前處理后，通過HPLC和實(shí)驗(yàn)室自研的三卡因試紙條進(jìn)行檢測并對比結(jié)果。如圖6-A 所示，可以看到在不同加標(biāo)濃度下，試紙條檢測結(jié)果與HPLC相近，最大偏差在5%以內(nèi)，說明簡化后的前處理方法可以用于試紙條檢測。從圖6-B中可以看到，實(shí)際樣品的HPLC和試紙條檢測結(jié)果類似，表明本研究所建立的樣品前處理方法適用于這2種方法，具有較好的應(yīng)用前景。

A-烏鱧；B-海鱸魚；C-南美白對蝦圖5 三種基質(zhì)中6種漁用麻醉劑的加標(biāo)回收率Fig.5 The recoveries of six kinds of fishery anesthetics in three kinds of substrates

A-加標(biāo)樣品檢測結(jié)果對比；B-實(shí)際樣品檢測結(jié)果對比圖6 免疫層析試紙條與HPLC檢測結(jié)果對比Fig.6 Comparison of results between immunochromatographic strip and HPLC

3 結(jié)論

本研究通過減少樣品和提取試劑的用量，降低了前處理設(shè)備的需求，將前處理時(shí)間控制在20 min內(nèi)，建立了一種漁用麻醉劑快速前處理方法，可應(yīng)用于其他多種漁用麻醉劑及多種基質(zhì)的前處理中。本研究所建立的前處理方法不僅適用于HPLC分析，還可以用于快檢試紙條檢測，為其他獸藥快速前處理方法的開發(fā)提供了一種思路，為現(xiàn)場檢測和實(shí)驗(yàn)室監(jiān)控提供了技術(shù)支撐。