張秋會，王晗，祝超智，崔文明，王小鵬，余小領(lǐng)，王興輝，趙改名

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州，450002)

發(fā)酵肉制品是指在天然或者人工控制的條件下，利用各種微生物發(fā)酵作用制作出來的具有特殊風(fēng)味、色澤和質(zhì)地，且可以保存較長時間的肉制品[1]。臘肉是一種中國傳統(tǒng)的腌臘肉制品,因其主要在臘月加工生產(chǎn)而命名。臘肉的種類繁多,因其具有獨特的煙熏色澤、氣味及口感,而廣泛流行于各地民間飲食中。隨著現(xiàn)代消費者對于色香味形的需求,傳統(tǒng)臘肉的生產(chǎn)已然逐漸跟不上現(xiàn)代食品所需的安全、營養(yǎng)、快捷的發(fā)展趨勢[2-3]。

目前市面上臘肉制品多數(shù)為手工作坊式生產(chǎn)，臘肉中的微生物經(jīng)過自然培養(yǎng)和發(fā)酵后，產(chǎn)生了獨特的風(fēng)味和口感[4-5]，但由于手工作坊生產(chǎn)條件的局限性，無法對產(chǎn)品中的微生物生長進(jìn)行有效控制，有益菌的生長受到影響，導(dǎo)致產(chǎn)品風(fēng)味產(chǎn)生了差異性，并且部分有害菌的生長，會造成產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)等質(zhì)量問題。我國在傳統(tǒng)發(fā)酵肉類食品工業(yè)化生產(chǎn)和技術(shù)現(xiàn)代化的改造等各個方面研究起步較晚,這種情況嚴(yán)重制約了我國傳統(tǒng)肉類食品加工行業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。因此添加不同的有益菌種可以有效改善臘肉的生產(chǎn)工藝[6-7]。酵母菌作為發(fā)酵菌株的一種，一直應(yīng)用于面粉、牛奶、酒類等產(chǎn)品。近年來，酵母菌開始應(yīng)用于發(fā)酵類肉制品中，其與乳酸菌進(jìn)行復(fù)配，可以增強(qiáng)發(fā)酵性能[8-9]。因此，篩選活性強(qiáng)、活菌數(shù)目多、適合發(fā)酵肉制品生產(chǎn)的優(yōu)秀酵母菌，開發(fā)適合中國人口味的發(fā)酵肉制品微生物發(fā)酵劑，是目前肉類工業(yè)重要研究方向之一。

本研究以信陽臘肉和湖南臘肉為分離材料，對菌株進(jìn)行分離純化分子生物學(xué)鑒定，并對篩選出的菌株的發(fā)酵特性進(jìn)行測定，找出適合臘肉加工生產(chǎn)的、發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：信陽臘肉、湖南臘肉，農(nóng)家自制。

試劑：孟加拉紅瓊脂、YPD液體培養(yǎng)基，青島海博；氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)、碳酸鈣、氯化鈉、亞硝酸鈉、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD 超凈工作臺，AIRTECH；Tprofessi Gradie梯度PCR儀,德國Biomera；F3全自動凝膠成像系統(tǒng)，SYNGENE；DYY-12電泳儀，北京市六一儀器廠；KB240可編程低溫培養(yǎng)箱，BINDER；TU-1901紫外可見光光度儀，北京普析通用儀器有限公司；8次/s 拍擊式均質(zhì)儀，Easy MIX；230V/Hz渦旋振蕩器，VORTEX GENIUS3。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

在無菌均質(zhì)袋里，添加樣品10 g和90 mL的無菌生理鹽水，用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)，用無菌生理鹽水在無菌試管中依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇3個合適的梯度，分別取200 μL稀釋液涂布于孟加拉紅瓊脂平板上，30 ℃培養(yǎng)24～72 h，挑選符合酵母菌形態(tài)的菌落，進(jìn)行反復(fù)劃線純化。對純化好的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的實驗。

1.3.2 16S rDNA分子生物學(xué)鑒定

挑取單菌，加入20 mL無菌水在95 ℃、20 min的條件下進(jìn)行PCR裂解，用所得的裂解液為模板。酵母菌所用序列如表1所示。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)時間如表2所示。

表1 通用引物序列Table 1 Universal primer sequences

表2 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件Table 2 PCR reaction system and reaction conditions

參考趙改名等[10]的方法，進(jìn)行測序。應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫，使用BLAST對基因同源性比較，確認(rèn)菌株名稱。

1.3.3 菌株特性的研究

1.3.3.1 生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定

參考高紹金[9]的方法，并加以修改。吸取菌液于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)50 h，每隔2 h測定其pH值和OD600值。

1.3.3.2 耐鹽特性

參考徐鑫等[11]的方法，并加以修改。吸取菌液于NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、2%、4%、6%的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，測定菌液的OD600值。

1.3.3.3 耐亞硝酸鹽特性

吸取菌液于NaNO2的添加量為0、50、100、150 mg/kg的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，測定菌液的OD600值[12]。

1.3.3.4 耐酸特性

吸取菌液于pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定菌液的OD600值[13]。

1.3.3.5 產(chǎn)醇試驗

吸取活化3代后的菌液，在孟加拉紅固體培養(yǎng)基上劃線，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。長出可見菌落后，在培養(yǎng)基倒入TTC上層培養(yǎng)基，使其覆蓋原來菌落。放置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，記錄菌落的呈色情況。

1.3.3.6 產(chǎn)氣試驗

采用杜氏小管發(fā)酵法，在30 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察杜氏小管中有無氣泡產(chǎn)生，記錄菌株的產(chǎn)氣情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理與分析

所有實驗均重復(fù)3次。采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)間的分析采用單因素方差分析(one way ANOVA)，顯著性水平均定位P<0.05。折線圖使用Origin進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 臘肉中微生物的分離與鑒定

對篩選出的臘肉中的酵母菌進(jìn)行分離純化，通過DNA序列比對，鑒定臘肉中酵母菌的種類。

獲得各菌株的基因組后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行電泳檢測。由圖1可知樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物約為500～750 bp，所有條帶分子質(zhì)量大小符合理論預(yù)期[14]。

圖1 PCR凝膠成像Fig.1 PCR gel imaging

利用NCBI數(shù)據(jù)庫，對分離菌株的DNA序列基進(jìn)行BLAST分析，確定菌種鑒定結(jié)果。根據(jù)表3可知，信陽臘肉中含有漢遜德巴利酵母、季也蒙畢赤酵母；湖南臘肉中含有假絲酵母。

表3 臘肉中13株分離菌株的鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of 13 strains isolated from Bacon

2.2 臘肉中分離酵母菌的特性研究

從分離得到的3種酵母菌中各選擇1株代表菌株，開展特性研究。

2.2.1 耐鹽特性研究

食鹽是肉制品加工過程中重要的調(diào)味劑，對發(fā)酵肉制品的安全性和感官質(zhì)量有重要影響，而耐鹽特性是選擇發(fā)酵菌種的重要因素之一[15]。臘肉中食鹽的添加量一般為4%～6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，水分含量會隨著發(fā)酵的進(jìn)行降低，鹽濃度隨之提高，菌株能夠有較好的NaCl的耐受性，可以在發(fā)酵過程中發(fā)揮自己的作用。許艷豐等[5]從臘肉中篩選的熱帶念珠菌和乳酒念株菌兩種酵母菌中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)超出6%時，菌株基本失去活性，不適宜菌株的生長。

由圖2可知，各菌株在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%時生長量最大，表明高NaCl含量會抑制菌株的生長。其中，菌株J1-2在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%條件下活性良好，相比較，H34和X35在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%條件下活性更強(qiáng)，由此可以了解到這3種菌株均有良好的耐鹽能力。這與劉英麗等[16]篩選出漢遜德巴利酵母和異常威克漢姆酵母的耐鹽特性一致，均可以耐高NaCl濃度的環(huán)境。

圖2 各菌種在不同鹽濃度下的生長能力Fig.2 Growth ability of each strain under different salt concentration

2.2.2 耐亞硝酸鹽特性研究

亞硝酸鹽是肉制品加工生產(chǎn)過程中重要的食品添加劑，有利于促進(jìn)發(fā)色、增進(jìn)風(fēng)味、抑制有害菌的生長，但是過量食用亞硝酸鹽會對人體帶來危害[17]。通常根據(jù)對發(fā)酵肉制品亞硝酸鹽添加量和發(fā)酵產(chǎn)生亞硝酸鹽，要求菌株最少耐受100 mg/kg的亞硝酸鹽，最好可以在150 mg/kg的亞硝酸鹽條件下生長良好。

由圖3可知，X35和H34在100 mg/kg時活性很強(qiáng)，與之比較，菌株J1-2在150 mg/kg時依舊有較好的亞硝酸鹽耐受性。由此可知，3種酵母菌均有很好的耐亞硝酸鹽性，其中J1-2的耐受性更強(qiáng)。這與劉英麗等[16]、陶森等[18]篩選的漢遜德巴利氏酵母以及季也蒙畢赤酵母有差異，他們篩選出的酵母菌耐亞硝酸鹽能力都比較強(qiáng)，這可能是他們所篩選的原料不同，一個是從豆豉里面篩選的，一個是從腌魚里面篩選的,樣品本身的亞硝酸鹽含量較高，使其耐受性更強(qiáng)。

圖3 各菌種在不同亞硝酸鹽含量下的生長能力Fig.3 Growth ability of different strains under different nitrite content

2.2.3 耐酸特性研究

發(fā)酵過程中通常不以單一的酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，大多會加入乳酸菌進(jìn)行復(fù)配，而乳酸菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，因此要求酵母菌需具有較強(qiáng)的耐酸能力[19]。由圖4可知，菌株J1-2在pH為3.0時生長能力最強(qiáng)，這與姚志芳等[20]篩選的畢赤酵母和李默等[21]篩選的畢赤酵母的耐酸性相近,在pH為3.0及以上時菌株活性很好；與黃治國等[22]篩選的季也蒙畢赤酵母進(jìn)行對比，兩種酵母菌均可以在pH為3.0時很好的生長。X35和H34在pH為5.5時活性很強(qiáng)，但隨著pH值的增加而逐漸失去了活性。與劉壯等[23]篩選的漢遜德巴利酵母進(jìn)行對比，本研究中X35的耐酸能力較差，這可能是由于劉壯等是從酸度較高的葡萄汁中篩選的菌株，具有很強(qiáng)的耐酸性。結(jié)果表明在發(fā)酵初期時，在酵母菌最適溫度下進(jìn)行發(fā)酵，此時pH值較高，酵母菌活性很強(qiáng)，然后在乳酸菌的最適溫度下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵的效果最好。

圖4 各菌種在不同pH下的生長能力Fig.4 Growth ability of different strains under different pH

2.2.4 菌株的生長曲線和產(chǎn)酸曲線研究

根據(jù)圖5可知，3種菌株都在0～8 h時為遲緩區(qū)，此階段菌株的生長速度較慢，時間較長；8～30 h時為對數(shù)區(qū)，此階段菌株的生長迅速增長，在30 h時到達(dá)穩(wěn)定期。與劉輝等[24]所用的釀酒酵母菌進(jìn)行對比，3種酵母菌的穩(wěn)定期滯后，但是在穩(wěn)定期時，吸光度比劉輝的高；其中J1-2的活性最強(qiáng)，在穩(wěn)定期時，菌液的濃度顯著高于另外兩種菌株。

圖5 菌株的生長曲線Fig.5 Growth curve of the strain

根據(jù)圖6產(chǎn)酸曲線可知，H34的pH值下降最快，在50 h時候pH值為4.79。其中X35和J1-2的最終的產(chǎn)酸能力差異性不明顯。篩選出的酵母菌與姚志芳等[20]從牦牛瘤胃和青稞酒槽篩選的畢赤酵母和釀酒酵母進(jìn)行對比，本實驗篩選出的菌株產(chǎn)酸速度慢但產(chǎn)酸多。圖5生長曲線可知，菌株的產(chǎn)酸和生長曲線對應(yīng)的遲緩區(qū)、對數(shù)區(qū)和穩(wěn)定期基本一致。一般情況下，乳酸菌的穩(wěn)定期時間較早，產(chǎn)酸能力高于酵母菌[10]，酵母菌發(fā)酵可降低發(fā)酵肉制品的酸度，增加風(fēng)味。

圖6 菌株的產(chǎn)酸曲線Fig.6 Acid production curve of the strain

2.2.5 菌株的產(chǎn)氣產(chǎn)醇研究

酵母菌在發(fā)酵過程產(chǎn)生氣體會破壞發(fā)酵肉制品的質(zhì)地，影響發(fā)酵產(chǎn)品的外觀，從而嚴(yán)重影響發(fā)酵產(chǎn)品的銷售。由表4可知，杜氏小管內(nèi)均沒有氣泡生成，結(jié)果表明這幾種酵母菌均不產(chǎn)氣。酵母菌能利用發(fā)酵基質(zhì)中的糖分，將其轉(zhuǎn)化為乙醇，賦予發(fā)酵肉制品特殊的醇香風(fēng)味，同時乙醇還可以與其他有機(jī)酸、醇類等風(fēng)味相互轉(zhuǎn)換，并生成乙酸乙酯等重要的風(fēng)味物質(zhì)。由表4可知，所有的菌株均產(chǎn)醇，H34的產(chǎn)醇能力最強(qiáng)。

表4 各菌株的產(chǎn)氣產(chǎn)醇情況Table 4 Gas and alcohol production of each strain

3 結(jié)論

本實驗以農(nóng)家自然發(fā)酵的臘肉為原料，從中分離出13株微生物，經(jīng)菌落特征以及DNA序列鑒定后，確定臘肉中有3種菌，分別為信陽臘肉中的漢遜德巴利酵母、季也蒙畢赤酵母，以及湖南臘肉中的假絲酵母。其中，季也蒙畢赤酵母在不同pH、NaCl濃度、亞硝酸鹽濃度等條件下的生長能力均符合發(fā)酵肉制品菌株的基本要求，且該菌株的生長速度較快，可作為肉制品發(fā)酵劑的潛在菌株；假絲酵母和漢遜德巴利酵母可以在高pH的環(huán)境下進(jìn)行發(fā)酵。這3種酵母菌有望在臘肉的工業(yè)生產(chǎn)中作為發(fā)酵菌種進(jìn)行使用。