韓翔鵬，何美珊，吳金松，李堯，劉丹，鐘青萍

(廣東省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)為革蘭氏陰性細(xì)菌，是常見的食源性致病菌之一。該菌主要存在于海洋環(huán)境中，常見于貝類、蝦、魚類等海產(chǎn)和鹽漬食品如咸菜、腌肉中[1]。研究表明副溶血弧菌毒力因子主要是耐熱直接溶血素(thermotolerant direct hemolysin, TDH)、相對(duì)耐熱溶血素(TDH-related hemolysin, TRH)和不耐熱溶血素(thermolabile hemolysin, TLH)，能引起急性腸胃炎，伴隨有嘔吐、腹痛、腹瀉、低燒和頭痛等癥狀[2]。在我國，副溶血弧菌引起的食物中毒事件高發(fā)于廣東、上海、浙江等沿海城市，并高居微生物性食物中毒的第二位[3]。在國外，副溶血弧菌引起中毒事件在日本、韓國、美國、西班牙、法國等地都有報(bào)道，嚴(yán)重危害著公眾健康。

副溶血弧菌能夠直接附著在食品加工設(shè)備或非食品加工部件的表面，如墻壁和排水管上形成生物被膜，造成食品污染或設(shè)備腐蝕[4]。生物被膜具有嚴(yán)重的致病性，能夠分泌不同表面因子和毒力因子。另外，生物被膜也能促進(jìn)細(xì)菌之間的基因轉(zhuǎn)移，這可能導(dǎo)致毒力株的數(shù)量增加[5]。與浮游形式相比，細(xì)菌以生物被膜形式存在時(shí)，耐藥性可增加10～1 000倍[6]。主要原因是生物被膜包裹的胞外多聚物基質(zhì)(多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA)可以形成一道天然的屏障，阻止抗生素在生物被膜內(nèi)部擴(kuò)散[7]。此外，營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、代謝廢物積累、致密的空間結(jié)構(gòu)等惡劣的微環(huán)境導(dǎo)致生物被膜內(nèi)部活的非可培養(yǎng)(viable but non-culturable, VBNC)狀態(tài)細(xì)胞的形成[8]。因此，生物被膜利用其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性以及對(duì)酸、堿、氧化劑甚至抗生素等多種藥物的耐受性，保護(hù)其內(nèi)部細(xì)菌在外界環(huán)境發(fā)生不利變化的情況下依然能夠生長和繁殖，這使得致病菌和腐敗菌的防控變得極其困難。

目前，在食品工業(yè)中，大多使用次氯酸鈉、乳酸、過氧化氫等消毒劑進(jìn)行滅菌處理，但這些消毒劑并不能完全清除致病菌生物被膜，而且其安全性也越來越受到消費(fèi)者的關(guān)注[9]。此外，長期使用抗生素已導(dǎo)致大量致病菌形成耐藥性，這對(duì)未來致病菌感染的防控與治療極其不利[10]。因此，作為消毒劑和抗生素替代品之一的植物精油是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。薰衣草精油(lavender essential oil,LEO)因其生物特性和獨(dú)特的香氣在食品工業(yè)中有很大的開發(fā)潛能。薰衣草精油最重要的特性是抗菌活性，如抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、殺線蟲等[11]。此外，薰衣草精油還具有多種藥理特性，如抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛和抗癌等[12]。因此本研究首先考察副溶血弧菌在32 ℃和10 ℃下生物被膜的形成情況，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析不同濃度的薰衣草精油和4種常用抗菌劑對(duì)兩種溫度下形成的副溶血弧菌成熟生物被膜的清除效果，并探究低溫環(huán)境對(duì)副溶血弧菌成熟生物被膜抗性的影響，這對(duì)消除副溶血弧菌污染、控制食品腐敗變質(zhì)和保障食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副溶血弧菌ATCC17802，廣東微生物菌種保藏中心；薰衣草精油，青島優(yōu)索化學(xué)科技有限公司；乳酸、檸檬酸、次氯酸鈉、過氧化氫，廣州牌化學(xué)試劑廠；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×SGExcel Fast SYBR mixture、四唑鎓鹽(XTT)、碘化丙啶(propidium iodide, PI)，上海生工(生物工程)股份有限公司；甲萘醌，美國Sigma公司；FITC Con-A染料、疊氮溴化丙錠(propidium monoazade, PMA)，美國Biotium公司。

含3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptic soy broth, TSB)：胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、NaCl 30 g、去離子水1 L，pH值為7.0～7.4，121 ℃滅菌20 min。含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基(tryptic soy agar, TSA)：在上述TSB配方的基礎(chǔ)上加入1.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂，用于平板計(jì)數(shù)法測定可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)。水解酪蛋白胨肉湯(mueller hinton broth, MHB)：稱取MHB培養(yǎng)基21 g，加入去離子水1 L，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Forma ClassⅡ A2生物安全柜、Multiskan FC酶標(biāo)儀，Thermo公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；650 W鹵鎢燈，德國Osram公司；CFX96TM熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；LSM 780激光共聚焦掃描顯微鏡，德國Zeiss公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株和培養(yǎng)條件

副溶血弧菌接種于含3% NaCl的TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h后，4 ℃條件下，6 000 r/min離心10 min收集菌體，以無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度為107CFU/mL備用。

1.3.2 生物被膜的形成及定量

采用結(jié)晶紫染色法(crystal violet staining, CV)測定生物被膜的生物量。在12孔板中垂直放置無菌玻璃片(20 mm×20 mm)，將副溶血弧菌菌液與TSB培養(yǎng)液按體積比1∶4混勻后(菌液終濃度為107CFU/mL)，以每孔5 mL加入到孔板中，在32 ℃及10 ℃分別培養(yǎng)1 d及30 d。培養(yǎng)完成后，將附著生物被膜的玻璃片用無菌PBS清洗3次后，65 ℃干燥固定30 min，再在孔中加入0.1%結(jié)晶紫染色30 min，用無菌PBS清洗3次，干燥后，加入33%冰乙酸脫色10 min，用酶標(biāo)儀測定595 nm下的吸光度。

1.3.3 代謝活性的測定

采用XTT法測定成熟生物被膜的代謝活性。XTT用PBS配制成1 g/mL的溶液，-80 ℃保存?zhèn)溆?，甲萘醌在使用前溶解在丙酮中，使其終濃度為1 mmol/L。將附有生物被膜的玻璃片轉(zhuǎn)移至含有PBS和玻璃珠的無菌離心管中，渦旋振蕩2 min后，收集生物被膜懸液。在96孔板中每孔中加入100 μL懸液，然后將XTT溶液和甲萘醌溶液按體積比12.5∶1混合后，每孔加入50 μL，黑暗中37 ℃溫育4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm下的吸光度。

1.3.4 生物被膜中活菌、可培養(yǎng)菌和VBNC菌數(shù)量的測定

采用PMA-qPCR法定量生物被膜中活菌數(shù)。取0.5 mL副溶血弧菌菌液于1.5 mL離心管中，加入PMA(終濃度為40 μmol/L)充分混勻，避光處理5 min 后開蓋置于冰上，距離650 W鹵鎢燈20 cm曝光5 min。處理后的樣品8 000 r/min離心2 min收集菌體，加入40 g/L溶菌酶37 ℃處理1 h。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取副溶血弧菌的DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)GenBank中的副溶血弧菌ATCC17802tlh基因，在保守區(qū)域用Primer 5.0設(shè)計(jì)PCR引物，并用Primer-BLAST驗(yàn)證。上游引物序列(5’→3’)TCGTGCGAAAGTGCTTGAGATG，下游引物序列(5’→3’)CGGTGAGTTGCTGTTGTTGGAT，由上海生工(生物工程)股份有限公司合成。

PMA-qPCR反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqPCR Master mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL(終濃度為20 μmol/L)，副溶血弧菌模板5 μL，ddH2O 6.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共39個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后72 ℃保持5 min。溶解曲線：65 ℃升至95 ℃，0.5 ℃/s。

采用稀釋平板法測定生物被膜中可培養(yǎng)菌數(shù)。吸取100 μL 10倍梯度稀釋的菌液，均勻涂布于含3% NaCl的TSA平板上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù)。

活菌數(shù)與可培養(yǎng)菌數(shù)的差值即為VBNC菌的數(shù)量。

1.3.5 最低抑菌濃度的測定

采用96孔板微量稀釋法測定不同抗菌劑的最低抑菌濃度(minimum inbibitory concentration, MIC)。將抗菌劑以MHB培養(yǎng)基2倍稀釋成8個(gè)梯度。每個(gè)孔中加入100 μL MHB培養(yǎng)基，然后，再在每個(gè)孔中加入100 μL菌液，使菌液終濃度為107CFU/mL，同時(shí)設(shè)置不含抗菌劑的對(duì)照組。孔板在32 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h后，用酶標(biāo)儀在595 nm處測定OD值。MIC被定義為抑制副溶血弧菌生長的抗菌劑的最低濃度。

1.3.6 不同抗菌劑對(duì)副溶血弧菌成熟生物被膜的清除作用

根據(jù)1.3.2中的方法，制備副溶血弧菌在32 ℃和10 ℃下形成的成熟生物被膜。將附有成熟生物被膜的玻璃片取出用PBS清洗3次，去除浮游菌，然后向各孔中分別加入5 mL不同濃度(1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC)的抗菌劑，在32 ℃和10 ℃處理3 h后，按照上述方法測定生物被膜生物量和代謝活性的變化，按公式(1)計(jì)算清除率，同時(shí)測定活菌數(shù)和可培養(yǎng)菌數(shù)。

(1)

1.3.7 激光共聚焦顯微鏡觀察生物被膜

將生物被膜用PBS緩沖液洗滌3次，用濾紙輕輕擦去多余的水分，黑暗環(huán)境下在載玻片上加入5 μL的綠色熒光素標(biāo)記刀豆球蛋白A(fluorescein isothiocyanate-concanavalin A, FITC Con-A)混合溶液，于4 ℃下放置30 min，再加入5 μL的PI于4 ℃下放置15 min，蓋上蓋玻片。在激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)下觀察生物被膜，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為500～550 nm，用Image J軟件分析生物被膜多糖厚度及死菌數(shù)量的變化。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次及以上，取平均值，利用GraphPad Prism 8.0作圖，以SPSS 20進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下副溶血弧菌生物被膜的形成

由圖1-a所示，副溶血弧菌在32 ℃下培養(yǎng)48 h后，生物被膜總量達(dá)到最多，代謝活性最強(qiáng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長至72 h，生物被膜總量及代謝活性也隨之減少，結(jié)果表明副溶血弧菌生物被膜在32 ℃下48 h后達(dá)到成熟。圖1-b表明，副溶血弧菌在10 ℃下第6天時(shí)生物量以及代謝活性最大。取副溶血弧菌在32 ℃、16 h 和10 ℃、6 d下的生物被膜計(jì)算活菌數(shù)，結(jié)果分別為(5.56±0.62) lgCFU/cm2、(5.48±0.1)lgCFU/cm2，通過t檢驗(yàn)沒有顯著差異。

a-32 ℃；b-10 ℃圖1 副溶血弧菌在32 ℃和10 ℃下形成的生物被膜的生物量和代謝活性Fig.1 The biomass and metabolic activity of V.parahaemolyticus biofilms formed at 32 ℃ and 10 ℃

2.2 薰衣草精油對(duì)不同溫度下形成的副溶血弧菌生物被膜的清除作用

薰衣草精油、檸檬酸、乳酸、次氯酸鈉、過氧化氫對(duì)副溶血弧菌MIC值分別為0.4%(體積分?jǐn)?shù))、0.312 5 mg/mL、0.625 mg/mL、1.25%(體積分?jǐn)?shù))、0.004 7%(體積分?jǐn)?shù))。對(duì)于32 ℃下形成的副溶血弧菌常溫生物被膜，薰衣草精油的清除率隨著處理濃度的增加而增大，在1/2 MIC～4 MIC清除率為36.39%～72.38%，值得注意的是，1/2 MIC和MIC的薰衣草精油對(duì)生物被膜的清除效果與其他4種抗菌劑差別不明顯，而2 MIC濃度的薰衣草精油對(duì)生物被膜清除率顯著高于其他4種抗菌劑(圖2-a)。對(duì)于10 ℃ 下形成的副溶血弧菌低溫生物被膜，1/2 MIC和MIC的薰衣草精油的清除率為58.20%和60.18%，明顯高于其他4種抗菌劑；2 MIC和4 MIC 的薰衣草精油表現(xiàn)出更加顯著的清除效果，清除率分別為65.40%和67.62%(圖2-b)?？偟膩碚f，薰衣草精油對(duì)副溶血弧菌成熟生物被膜清除效果優(yōu)于其他4種抗菌劑，而且對(duì)低溫生物被膜也展示出較強(qiáng)的清除能力。

a-32 ℃；b-10 ℃圖2 不同濃度的抗菌劑對(duì)32 ℃和10 ℃下形成的副溶血弧菌生物被膜的清除效果Fig.2 The removal effects of antimicrobial agents on mature biofilms of V.parahaemolyticus formed at 32 ℃ and 10 ℃注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 薰衣草精油對(duì)不同溫度下形成的副溶血弧菌生物被膜代謝活性的影響

對(duì)于32 ℃下形成的副溶血弧菌常溫生物被膜，薰衣草精油可顯著降低其代謝活性，強(qiáng)于其他4種抗菌劑，在1/2 MIC～4 MIC，代謝活性下降35.72%～71.38%(圖3-a)。對(duì)于10 ℃下形成的副溶血弧菌低溫生物被膜，1/2 MIC～4 MIC的薰衣草精油可使其代謝活性降低42.06%～50.48%(圖3-b)。薰衣草精油能夠通過破壞副溶血弧菌成熟生物被膜作用于內(nèi)部菌體，從而影響生物被膜細(xì)胞的代謝活性。此外，結(jié)果亦表明低溫生物被膜對(duì)抗菌劑的抗性明顯強(qiáng)于常溫生物被膜。

2.4 薰衣草精油處理對(duì)副溶血弧菌生物被膜活菌數(shù)的影響

采用4種濃度的薰衣草精油處理2種溫度下形成的副溶血弧菌生物被膜3 h，活菌數(shù)和可培養(yǎng)菌數(shù)如圖4-a所示，經(jīng)過薰衣草精油處理后，32 ℃生物被膜較10 ℃生物被膜菌數(shù)下降明顯，4 MIC處理下，32 ℃生物被膜活菌數(shù)減少3.96 lgCFU/cm2，可培養(yǎng)菌數(shù)減少5.94 lgCFU/cm2。圖4-b顯示10 ℃低溫生物被膜活菌數(shù)減少2.88 lgCFU/cm2，可培養(yǎng)菌數(shù)減少3.93 lgCFU/cm2。上述結(jié)果表明，薰衣草精油對(duì)副溶血弧菌成熟生物被膜具有良好的清除效果。此外，生物被膜內(nèi)活菌數(shù)與可培養(yǎng)菌數(shù)的差值即為VBNC菌的數(shù)量，表明薰衣草精油處理后可誘導(dǎo)副溶血弧菌生物被膜中VBNC菌的形成。

a-32 ℃；b-10 ℃圖3 不同濃度的抗菌劑對(duì)32 ℃和10 ℃下形成的副溶血弧菌生物被膜代謝活性的影響Fig.3 The effects of antimicrobial agents on the metabolic activity of V.parahaemolyticus mature biofilms formed at 32 ℃ and 10 ℃

a-32 ℃；b-10 ℃圖4 薰衣草精油對(duì)32 ℃和10 ℃下形成的副溶血弧菌生物被膜細(xì)胞的影響Fig.4 The effects of LEO on the cells in V.parahaemolyticus biofilms formed at 32 ℃ and 10 ℃

2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察薰衣草精油處理下的生物被膜結(jié)構(gòu)

使用CLSM觀察4 MIC的薰衣草精油對(duì)副溶血弧菌生物被膜的清除效果，圖5-a和圖6-a分別為未處理的32 ℃和10 ℃下形成的副溶血弧菌成熟生物被膜，呈現(xiàn)出密集分布的三維結(jié)構(gòu)，而且多糖和活/死細(xì)胞在生物被膜中分布密集，活細(xì)胞數(shù)量顯著高于死細(xì)胞。圖5-c是4 MIC薰衣草精油處理后的常溫生物被膜，多糖大部分被清除，綠色熒光面積下降54%；且含有大量死細(xì)菌，紅色熒光面積增加80%。圖6-c為4 MIC薰衣草精油處理后的低溫生物被膜，多糖含量比對(duì)照組顯著減少，死菌增多。上述結(jié)果表明薰衣草精油能夠破壞生物被膜的結(jié)構(gòu)，有效清除生物被膜胞外多糖，殺滅部分生物被膜細(xì)胞。此外，薰衣草精油對(duì)低溫生物被膜的清除能力弱于常溫生物被膜，表明低溫生物被膜的抗性較強(qiáng)。

a、c-處理前后的32 ℃生物被膜胞外多糖和死菌分布；b、d-處理前后的32 ℃生物被膜胞外多糖和死菌的熒光強(qiáng)度圖5 CLSM觀察4 MIC薰衣草精油處理32 ℃下形成的副溶血弧菌生物被膜結(jié)構(gòu)Fig.5 The structure of the biofilm formed at 32 ℃ treated with 4 MIC of LEO observed by CLSM注：綠光標(biāo)記多糖，紅光標(biāo)記死菌(下同)

a、c-處理前后的10 ℃生物被膜胞外多糖和死菌分布；b、d-處理前后的10 ℃生物被膜胞外多糖和死菌的熒光強(qiáng)度圖6 CLSM觀察4 MIC薰衣草精油處理10 ℃下形成的副溶血弧菌生物被膜結(jié)構(gòu)Fig.6 The structure of the biofilm formed at 10 ℃ treated with 4 MIC of LEO observed by CLSM

3 結(jié)論

本研究考察了32、10 ℃下副溶血弧菌生物被膜的形成情況，分析了薰衣草精油對(duì)其成熟生物被膜的清除作用，并選擇食品工業(yè)中常用的幾種抗菌劑作為對(duì)照處理。32 ℃是副溶血弧菌適宜的生長溫度，而且為中國南方夏季常見的溫度。此外，冷藏食品在整個(gè)貯藏、運(yùn)輸和銷售過程中的溫度為2～5 ℃，通常會(huì)升高至10 ℃左右[13]。CHUNG等[14]測定不同貯藏溫度下韓國傳統(tǒng)醬腌蟹中副溶血弧菌的生長曲線發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌在10 ℃下能長時(shí)間存活。WONG等[15]研究也發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌能在4～30 ℃下存活。BURNHAM等[16]將6 lgCFU/mL的副溶血弧菌在10 ℃ 下培養(yǎng)10 d，其數(shù)目可達(dá)8.31 lgCFU/mL。因此，本研究亦考察10 ℃低溫對(duì)副溶血弧菌生物被膜形成及抗性的影響。我們使用激光共聚焦顯微鏡并結(jié)合Z-TACK層切技術(shù)和IMAGE J軟件分析副溶血弧菌生物被膜結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，低溫生物被膜厚度較常溫生物被膜略薄，但底部細(xì)胞分布較密集，而常溫生物被膜細(xì)胞分布較均勻。

此外，研究也發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌低溫生物被膜對(duì)抗菌劑的抗性明顯強(qiáng)于常溫生物被膜，可能的原因是低溫環(huán)境能夠誘導(dǎo)副溶血弧菌成熟生物被膜中VBNC狀態(tài)細(xì)胞的形成。VBNC狀態(tài)是指細(xì)菌不能在傳統(tǒng)培養(yǎng)基上生長繁殖，但仍具有活性，并可在適宜條件下復(fù)蘇的特殊狀態(tài)[21]。與正常細(xì)胞相比，VBNC細(xì)胞表現(xiàn)出比可培養(yǎng)的細(xì)胞更低的代謝活性，但能繼續(xù)保持膜完整性并產(chǎn)生蛋白質(zhì)[22]。NOWAKOWSKA等[23]發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)的創(chuàng)傷弧菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)，從而對(duì)氧化應(yīng)激、熱、pH、滲透壓、抗生素、乙醇和重金屬具有更強(qiáng)的耐受性。我們研究發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌在低溫條件下形成的成熟生物被膜中約有1/3的細(xì)胞進(jìn)入了VBNC狀態(tài)。黃韻等[24]研究也表明，單增李斯特菌在2 ℃的低溫條件下培養(yǎng)比在25 ℃更早的進(jìn)入VBNC狀態(tài)。本文研究表明，薰衣草精油對(duì)成熟生物被膜細(xì)胞的殺滅作用隨著濃度的增加而增大，生物被膜中活細(xì)胞和可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量逐漸降低，而且其對(duì)常溫生物被膜細(xì)胞殺滅作用顯著強(qiáng)于低溫生物被膜細(xì)胞，這一結(jié)論也證實(shí)常溫生物被膜對(duì)抗菌劑具有更高的敏感性。