陸依凡，鄒多宏，丁如愿，侯愛兵

外傷、感染、腫瘤切除等原因通常會(huì)造成骨組織缺損，小范圍的缺損?？梢宰杂^大范圍的缺損如臨界骨缺損則無法實(shí)現(xiàn)自我修復(fù)。目前，臨床上常用的方法有自體骨移植、異體骨移植，但供源短缺或者免疫反應(yīng)等限制了其應(yīng)用[1]。應(yīng)用骨組織工程修復(fù)臨界骨缺損近年來逐漸成為研究的熱點(diǎn)，其中生物支架在整個(gè)修復(fù)過程中起到至關(guān)重要的過程，被稱為組織工程的“基石”[2]。

殼聚糖(chitosan, CS)是一種豐富的天然多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性、抗菌性、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于組織工程研究中[3-5]。β-磷酸三鈣(β-TCP)具有優(yōu)異的降解性能和骨傳導(dǎo)性，能夠較好的修復(fù)骨缺損。本實(shí)驗(yàn)將CS和β-TCP混合，通過雙向凍干技術(shù)制備了具有互相平行的薄層狀、多孔狀生物支架，該支架具有優(yōu)異的壓縮強(qiáng)度和彈性形變能力，良好的生物相容性以及誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力，具有修復(fù)臨界骨缺損的潛力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雄性大鼠，3周齡，體質(zhì)量(50±5)g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程對(duì)動(dòng)物處置均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求(批號(hào)：LLSC20200362)。

1.2 合成材料殼聚糖(85%去乙酰化程度)、 β-TCP(生物醫(yī)用級(jí)，≥ 98%，β-phase basis，<0.2 μm，美國aladdin公司)。

1.3 主要試劑和儀器DEME、胰酶消化液(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；BCIP/BNT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(上海碧云天公司)；二氧化碳孵育箱(美國Thermo公司)；CCK-8試劑(日本同仁公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-tek公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡LSM880、掃描電子顯微鏡(德國蔡司公司)；X線衍射儀(荷蘭帕納科公司)；高溫高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)。PCR引物(上海生物工程股份有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司)；力學(xué)萬能機(jī)(美國英斯特朗公司)。

1.4 方法

1.4.1大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 3周齡雄性SD大鼠脫頸處死，在超凈工作臺(tái)中去除表皮及肌肉組織。將后肢股骨兩端骨骺端剪去，用5 ml注射器將骨髓沖出至培養(yǎng)皿中，加入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃，5%二氧化碳條件下進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)至7 d后對(duì)原代細(xì)胞進(jìn)行傳代。

1.4.2雙向凍干制備CS-β-TCP支架 將CS-β-TCP溶液倒入預(yù)制的硅膠模具中，模具的一側(cè)浸入液氮，使得冰核在溶液底生成并且呈現(xiàn)平行的、長程排列的冰片。冷凍完成后將其轉(zhuǎn)入真空凍干機(jī)凍干，使用0.3 mol/L NaOH乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行除酸，隨后用去離子水反復(fù)清洗樣品。

1.4.3 力學(xué)測試將凍干的復(fù)合組(CS-β-TCP支架)支架制備成10 mm×10 mm×10 mm的測試樣品，通過力學(xué)萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行壓縮循環(huán)測試，以1 mm/s的速度將樣品壓縮40%、60%、80%，觀察其回彈能力。記錄壓縮-回彈過程并繪制壓縮循環(huán)曲線。

1.4.4結(jié)構(gòu)表征 將CS-β-TCP支架制備成2 mm×2 mm×2 mm的測試樣品，將樣品截面以導(dǎo)電膠固定于樣品臺(tái)，低真空下噴金后使用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)在5 kV的加速電壓下拍攝樣品，能量分散光譜(energy disperse spectroscopy, EDS)觀察各元素分布。將復(fù)合組支架平鋪于試件臺(tái)上，用X線衍射儀分析進(jìn)行掃描，分析其組成成分。

1.4.5細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn) 用打孔器將復(fù)合組支架制備成直徑5 mm，厚度2 mm的圓形樣品。每個(gè)樣品接種1×104個(gè)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，空白對(duì)照組僅在96孔板底接種細(xì)胞，每組5個(gè)副孔。1 d、4 d、7 d分別吸除培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍后，加入CCK-8溶液(CCK-8 ∶DEME=1 ∶9)200 μl/孔，37 ℃孵育2 h后使用酶標(biāo)儀檢測每孔在450 nm處的吸光度值。

1.4.6細(xì)胞活力和細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) ①細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)(活死染法)：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種在支架上于96孔板中培養(yǎng)1、4、7 d后棄除原有培養(yǎng)基，PBS清洗3遍后，將10 μl calcein-AM和15 μl propidium iodide溶解于5 ml PBS中混勻，每孔加入100 μl 混合液，37 ℃孵育15 min后，PBS清洗3遍，使用激光共聚焦檢測細(xì)胞染色情況，其中活細(xì)胞為綠色熒光，死細(xì)胞為紅色熒光。②細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種在復(fù)合組支架上3 d后，PBS清洗3遍，用4%多聚甲醛固定樣品30 min。0.1%的Triton-X 100對(duì)支架上細(xì)胞破膜10 min，隨后用1%的BSA溶液封閉樣品1 h。使用0.1%的羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色30 min，DAPI對(duì)細(xì)胞核染色5 min。隨后用激光共聚焦進(jìn)行檢測。

1.4.7細(xì)胞成骨分化的檢測 將5×105個(gè)鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別接種在純殼聚糖組和復(fù)合組支架上培養(yǎng)，每3 d換液1次，7 d時(shí)用TRIzol提取細(xì)胞中的RNA并根據(jù)試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用qRT-PCR檢測骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP2)、RUNX相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX family transcription factor 2, RUNX2)、一型膠原(collagen type I, COL1)的基因表達(dá)水平(引物序列見表1)。并對(duì)支架進(jìn)行堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)染色，檢測ALP活性。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 CS-β-TCP支架表征CS-β-TCP支架的掃描電鏡下呈現(xiàn)相互平行的薄層多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小均勻，且具有良好的貫通性。見圖1A。圖1B為CS-β-TCP支架的壓縮循環(huán)曲線，結(jié)果表明CS-β-TCP支架具有良好的壓縮性能，支架壓縮80%后仍可恢復(fù)原有形狀。

圖1 CS-β-TCP支架的力學(xué)表征

2.2 CS-β-TCP支架的成分檢測XRD結(jié)果顯示，復(fù)合組支架中含有β-TCP顆粒，EDS結(jié)果表明，β-TCP顆粒均勻的分布在復(fù)合組支架的薄層結(jié)構(gòu)上。見圖2。

圖2 CS-β-TCP支架成分分析

2.3 CS-β-TCP支架生物相容性實(shí)驗(yàn)CCK-8結(jié)果顯示，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與材料共培養(yǎng)1、4、7 d后，與空白對(duì)照相比，純殼聚糖組和復(fù)合組的吸光度無明顯差異，細(xì)胞增殖未受到抑制，仍保持較高的增殖活性，見圖3。

圖3 支架與細(xì)胞共培養(yǎng)后的生物相容性

2.4 細(xì)胞活性檢測結(jié)果如圖4所示，支架上死細(xì)胞較少，細(xì)胞活性高，同時(shí)細(xì)胞表現(xiàn)出良好的增殖能力。復(fù)合組支架對(duì)細(xì)胞活性無影響。

圖4 CS-β-TCP支架接種細(xì)胞后細(xì)胞活力檢測Calcein：鈣黃綠色，活細(xì)胞為綠色；PI：碘化鉀，死細(xì)胞為紅色

2.5 細(xì)胞黏附能力大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種在CS-β-TCP支架72 h 后，熒光染色結(jié)果表明細(xì)胞可以較好的黏附在復(fù)合組支架上。此外，細(xì)胞能夠較好的張入層狀微孔結(jié)構(gòu)中，為細(xì)胞的黏附和分化提供了良好的力學(xué)刺激，見圖5。

圖5 細(xì)胞接種在CS-β-TCP支架72h后，細(xì)胞黏附的檢測DAPI：染細(xì)胞核為藍(lán)色；Phalloidin：染細(xì)胞骨架為紅色

2.6 支架的促成骨分化能力qRT-PCR結(jié)果表明，和純殼聚糖組相比，復(fù)合組的成骨相關(guān)基因BMP2, RUNX2 以及COL1 的表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 3,F=55.78;P=0.000 3,F=38.20;P=0.021 5,F=15.91)，且培養(yǎng)至第7 d、14 d時(shí)，ALP染色結(jié)果顯示，復(fù)合組的ALP陽性結(jié)果更加明顯，見圖6。

圖6 CS-β-TCP支架的促成骨分化能力的檢測A：成骨相關(guān)基因表達(dá)的檢測；B：堿性磷酸酶染色

3 討論

β-TCP是目前臨床上較為常用的骨科材料，具有良好的生物相容性，骨傳導(dǎo)性以及降解性[6-7], 廣泛應(yīng)用于臨床骨缺損的再生修復(fù)。然而單純的磷酸鹽生物支架脆性較高，成分較為單一，不能較好的模擬天然骨的結(jié)構(gòu)。常用的骨水泥作為骨組織缺損修復(fù)策略也具有一定局限性，其較小的孔徑阻礙血管的長入，導(dǎo)致其中間部位營養(yǎng)缺乏而造成組織壞死，進(jìn)一步影響缺損修復(fù)的效果。殼聚糖作為天然多聚物，其結(jié)構(gòu)與骨組織中的糖胺聚糖相似，在成骨細(xì)胞的附著和礦化方面具有重要的作用[8-9]，但單純殼聚糖的機(jī)械性能較差，作為支架修復(fù)骨缺損時(shí)不能提供足夠的機(jī)械支持，從而影響骨組織的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)將β-TCP顆粒與殼聚糖溶液混勻，通過雙向凍干技術(shù)制備的復(fù)合物支架，不僅能夠降低β-TCP的生物脆性，提高殼聚糖的機(jī)械強(qiáng)度，同時(shí)有機(jī)物和無機(jī)物的結(jié)合使得CS-β-TCP復(fù)合層狀支架能夠更好的模擬骨組織的結(jié)構(gòu)。雙向凍干技術(shù)使得支架具備較多的孔徑結(jié)構(gòu)以允許血管組織的長入，能夠更好的進(jìn)行營養(yǎng)的交換和代謝物的更新，從而保證支架中心營養(yǎng)充足，加速骨缺損的修復(fù)。此外，平行的薄層狀結(jié)構(gòu)賦予支架優(yōu)異的彈性性能，可以保證支架處于壓縮狀態(tài)而植入缺損部位，殼聚糖骨架的形狀記憶能力使得支架能夠自適應(yīng)缺損的形狀，這些特點(diǎn)使得CS-β-TCP復(fù)合層狀支架在不規(guī)則缺損的修復(fù)和微創(chuàng)領(lǐng)域中具有一定的潛力[10]。

CS-β-TCP復(fù)合層狀支架的掃描電鏡可以觀察到β-TCP顆粒均勻的分布在層狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，使得層狀結(jié)構(gòu)具有較為粗糙的表面，這種結(jié)構(gòu)對(duì)于細(xì)胞的黏附可能具有一定的幫助，同時(shí)殼聚糖表面的正電荷可以吸引帶負(fù)電的細(xì)胞膜，促進(jìn)細(xì)胞的黏附[11-12]。間充質(zhì)干細(xì)胞黏附于支架后，同時(shí)受到機(jī)械張力和鈣離子的刺激而向成骨細(xì)胞分化。此外，殼聚糖可通過募集巨噬細(xì)胞從而減少炎癥反應(yīng)，使得CS-β-TCP復(fù)合層狀支架在修復(fù)骨缺損的同時(shí)抑制炎癥的發(fā)生,更好的促進(jìn)骨缺損的修復(fù)[13]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞可以較好的與支架共存，同時(shí)能夠隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增殖。這些結(jié)果證明該CS-β-TCP復(fù)合層狀支架具備生物支架的基本要求，不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒副反應(yīng)。

體外檢測BMP2、RUNX2和COL1的變化可以反映間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的程度。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明與陰性對(duì)照組(純殼聚糖組)相比，復(fù)合組支架能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞顯著表達(dá)BMP2、RUNX2和COL1基因，表明該復(fù)合組支架可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。ALP是成骨分化的標(biāo)志性酶，在骨礦化過程中起到重要作用[14]，對(duì)復(fù)合組支架進(jìn)行ALP染色，與陰性對(duì)照組相比，復(fù)合組支架的陽性結(jié)果更為明顯，表明該組支架上的間充質(zhì)干細(xì)胞骨礦化程度更高。qRT-PCR和ALP染色結(jié)果共同表明復(fù)合組支架具有明顯的促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力。但本文所研究材料結(jié)構(gòu)較為單一，成分上不存在梯度變化，對(duì)于復(fù)雜的缺損和位于兩種組織交界處的缺損修復(fù)效果較局限，例如關(guān)節(jié)處缺損常涉及表面的軟骨和軟骨下骨組織，且骨和軟骨組織具有不同的硬度和礦物質(zhì)含量，單一支架難以同時(shí)修復(fù)骨和軟骨缺損。因此該材料需進(jìn)一步改進(jìn)，使其能夠適應(yīng)復(fù)雜缺損處的梯度變化，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)雜缺損的修復(fù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)制備的CS-β-TCP復(fù)合層狀支架具有良好的機(jī)械性能和生物相容性，體外實(shí)驗(yàn)表明能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化，為骨缺損的修復(fù)提供一種新的思路。