王燚燦，洪依婷，黃 猛，張家祥，王 峰，彭家樂，朱啟星,3

職業(yè)暴露于三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)的部分工人可出現(xiàn)類似于重癥藥疹樣的皮膚黏膜損害，伴肝臟和腎臟等多臟器功能紊亂，在我國被定義為三氯乙烯藥疹樣皮炎(occupational medicamentosa-like dermatitis due to trichloroethylene，OMDT)[1-2]。盡管OMDT的發(fā)病率低，但其病死率可高達(dá)8.6%[3]。長期的糖皮質(zhì)激素治療導(dǎo)致患者出現(xiàn)多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[4]。腎臟損害是加重患者病情、影響預(yù)后的主要因素[5]，然而目前關(guān)于OMDT腎臟損傷的內(nèi)在機(jī)制尚不明確。

前期研究[6-7]表明，TCE致敏陽性小鼠同時(shí)存在腎小球和腎小管的結(jié)構(gòu)和功能損害。近年來，大量研究[8-9]表明組織蛋白酶L(cathepsin L，CTSL)廣泛參與多種腎臟疾病的發(fā)病過程，有望成為腎臟疾病治療的新靶點(diǎn)。CTSL是半胱氨酸蛋白酶家族成員，在一定刺激下從溶酶體釋放出，介導(dǎo)細(xì)胞死亡和蛋白質(zhì)降解等生物學(xué)過程。研究[6]表明TCE致敏小鼠受損的足細(xì)胞中存在CTSL的過表達(dá)，藥理學(xué)抑制CTSL的過表達(dá)可有效改善腎臟損害情況，但是其具體作用機(jī)制尚不明確。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是組織蛋白酶的重要底物之一，可介導(dǎo)炎癥和凋亡等生物過程[10]。該研究旨在探討CTSL介導(dǎo)TCE致敏小鼠腎臟損傷的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料三氯乙烯(分析純，貨號(hào)：251402)、弗氏完全佐劑(FCA，貨號(hào)：F5881)在美國Sigma公司購買；蘇木精染液(貨號(hào)：ZLI-9610)、伊紅(貨號(hào)：ZLI-9613)在北京中杉金橋生物公司購買；RIPA 裂解液(貨號(hào)：P0013B)、苯甲基磺酰氟(PMSF，貨號(hào)：ST505)、BCA蛋白濃度檢測試劑盒(貨號(hào)：P0012)和5X 蛋白上樣緩沖液(貨號(hào)：P0015L)在上海碧云天生物技術(shù)有限公司購買；4%多聚甲醛(貨號(hào)：BL539A)和二抗(貨號(hào)：BL003A,BL001A)在美國Biosharp公司購買；ECL發(fā)光液(貨號(hào)：K-12045-D50)在美國Advansta公司購買；TUNEL染色試劑盒(貨號(hào)：11772465001)在美國Roche公司購買；尿素氮(BUN，貨號(hào)：C013-2-1)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；在 CTSL(貨號(hào)：sc-390385)、PKC(貨號(hào)：sc-17804)、p-PKC(貨號(hào)：sc-377565)的鼠單克隆抗體和CTSL抑制劑(貨號(hào)：sc-364671)在美國Santa公司購買；β-actin單克隆抗體(貨號(hào)：8457s)在美國CST公司購買，驢抗鼠IgG熒光二抗(貨號(hào)：ab150108)在美國abcam公司購買。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型建立在安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠41只，6～8 周齡，體質(zhì)量(16～18)g。待適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后隨機(jī)將小鼠分為空白對(duì)照組5只、溶劑對(duì)照組5只、TCE處理組15只以及TCE+CTSLi處理組16只?？瞻讓?duì)照組不做任何處理；溶劑對(duì)照組小鼠使用不含TCE的相同比例丙酮和橄欖油的混合溶液，其余處理與TCE處理組相同；TCE小鼠致敏模型按既往建模方法進(jìn)行建立[11]：對(duì)小鼠背部剃毛，實(shí)驗(yàn)第1天對(duì)TCE處理組和TCE+CTSLi處理組小鼠進(jìn)行皮下注射100 μl的50% TCE 溶液與等量FCA的混合液，在第4、7、10 天背部涂抹100 μl 50%的TCE 溶液，最后在第17、19 天對(duì)小鼠皮膚涂抹100 μl的30%TCE溶液分別進(jìn)行初次和末次激發(fā)。TCE+CTSLi處理組在初末激發(fā)2 h前進(jìn)行腹腔注射10 mg/kg劑量的CTSL抑制劑。末次激發(fā)24 h后進(jìn)行小鼠皮膚致敏評(píng)分，末次激發(fā)72 h后，麻醉、處死小鼠，無菌取腎臟組織，用于組織病理學(xué)和相關(guān)蛋白的水平檢測。

1.3 皮膚致敏反應(yīng)視覺評(píng)分于末次激發(fā)24 h后，對(duì)小鼠的皮膚表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：① 0分：無反應(yīng)；② 1分：散在或小塊紅斑；③ 2分：中度彌漫的紅斑、輕微水腫；④ 3分：嚴(yán)重紅斑、水腫。根據(jù)評(píng)分≥1分即評(píng)為致敏陽性組，反之評(píng)為致敏陰性組，即將TCE處理組和TCE+CTSLi處理組分為TCE致敏陽性組、TCE+CTSLi致敏陰性組、TCE+CTSLi致敏陽性組和TCE+CTSLi致敏陰性組。

1.4 免疫熒光將腎臟組織進(jìn)行烤片，脫蠟，過碘酸阻斷過氧化物酶(HRP)孵育20 min，PBS洗滌3次，枸櫞酸抗原修復(fù)15 min，洗滌，0.5% Triton X-100在PBS中通透切片30 min，洗滌。血清封閉2 h，CTSL一抗(稀釋比1 ∶400)于4 ℃過夜，24 h后，切片恢復(fù)至室溫后，PBS洗滌后二抗(稀釋比1 ∶1 000)避光孵育2 h，DAPI染核15 min，封片并拍照。

1.5 小鼠腎臟病理學(xué)檢查取部分新鮮小鼠腎臟組織固定于4%多聚甲醛3 d，石蠟包埋制備腎臟組織蠟塊，切片厚度為0.4 μm，以進(jìn)行常規(guī)HE染色，顯微鏡觀察組織病理學(xué)改變。

取新鮮小鼠腎皮質(zhì)在2.5%戊二醛和1%鋨酸中固定10 h后，按標(biāo)準(zhǔn)化制備程序制成標(biāo)本，透射電鏡觀察腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.6 TUNEL染色TUNEL染色按照試劑盒說明書進(jìn)行，蛋白酶K穿孔后，腎臟切片用TUNEL反應(yīng)混合物在37 ℃孵育30 min，然后用DAB顯色，顯微鏡拍照，Image J軟件計(jì)算凋亡細(xì)胞率。

1.6 Western blot檢測PKC、p-PKC蛋白表達(dá)水平新鮮腎臟組織在RIPA裂解液勻漿裂解后，提取總蛋白，并測定蛋白濃度。12.5% SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)束后，200 mA恒流濕轉(zhuǎn)3 h；PVDF膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，將膜與針對(duì)PKC(稀釋比1 ∶1 000)、p-PKC(稀釋比1 ∶1 000)和β-actin(稀釋比1 ∶10 000)的抗體于4 ℃孵育過夜。第2天，PBST洗膜3次，10 min/次，二抗(稀釋比1 ∶10 000)室溫孵育2 h后，重復(fù)洗膜，化學(xué)發(fā)光儀顯影，Image-Pro Plus software6.0軟件分析條帶光密度值。

2 結(jié)果

2.1 小鼠皮膚致敏情況與腎臟病理學(xué)改變情況根據(jù)皮膚致敏反應(yīng)對(duì)小鼠進(jìn)行評(píng)分，具體如下：空白組與溶劑組小鼠背部均未見明顯水腫和紅斑，致敏評(píng)分均為0。TCE處理組致敏率為53.3%(8/15)，其中評(píng)為1分的4只，評(píng)為2分的4只。TCE+CTSLi處理組致敏率為50.0%(8/16)，其中評(píng)為1分的4只，評(píng)為2分的4只。且兩組間小鼠致敏率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

HE染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、TCE致敏陰性組和TCE+CTSLi致敏陰性組小鼠的腎小球與腎小管結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病理學(xué)損傷。與溶劑對(duì)照組相比，TCE致敏陽性組小鼠的腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞水腫、空泡變性等。而TCE+CTSLi致敏陽性組小鼠較TCE致敏陽性組小鼠腎臟上述損傷減輕。經(jīng)檢測小鼠血清BUN水平發(fā)現(xiàn)，與其他組相比，TCE致敏陽性組(25.268±5.680)和TCE+CTSLi致敏陽性組(17.365±2.265)小鼠血清中的BUN水平升高，而TCE+CTSLi致敏陽性組較TCE致敏陽性組BUN的水平有一定程度下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,F=18.283)；其他組BUN水平相對(duì)較低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖1 各組小鼠腎臟病理改變情況 HE染色 ×400 圖2 各組小鼠血清BUN水平

2.2 CTSL過表達(dá)對(duì)TCE致敏小鼠腎臟損害的影響本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTSL在TCE致敏陽性組小鼠腎臟尤其在腎小球上高表達(dá)，見圖3。電鏡結(jié)果顯示，TCE致敏陽性組小鼠腎小球?yàn)V過膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，基底膜增厚，且厚度不均，足細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)受損，出現(xiàn)融合、消失，線粒體水腫和空泡樣變性，見圖4。與TCE致敏陽性組相比，TCE+CTSLi致敏陽性組小鼠CTSL表達(dá)水平降低(P<0.05，F(xiàn)=82.438)、腎小球基底膜損傷程度減輕。

圖3 不同組別小鼠腎臟CTSL表達(dá)情況

圖4 不同組別小鼠腎臟形態(tài)學(xué)改變情況電鏡 ×30 000

2.3 CTSL誘導(dǎo)TCE致敏小鼠腎臟結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡通過TUNEL染色評(píng)估CTSL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組、TCE致敏陰性組、TCE+CTSLi致敏陰性組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡比例未見明顯異常，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與TCE致敏陰性組相比，TCE致敏陽性組小鼠腎小球凋亡細(xì)胞比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與TCE致敏陽性組相比，TCE+CTSLi致敏組小鼠腎小球凋亡細(xì)胞比例下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不僅如此，腎小管細(xì)胞凋亡情況與腎小球相似，TCE致敏陽性組小鼠腎小管凋亡細(xì)胞比例高于其他各組(P<0.05)，而TCE+CTSLi致敏陽性組小鼠腎小管凋亡細(xì)胞比例低于TCE致敏陽性組，見圖5。以上結(jié)果說明，CTSL可以通過同時(shí)誘導(dǎo)腎小球和腎小管細(xì)胞凋亡，加重TCE致敏小鼠腎結(jié)構(gòu)損害。

圖5 不同組別小鼠腎臟結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡情況TUNEL染色 ×1 000

2.4 CTSL激活TCE致敏小鼠腎臟PKC信號(hào)分子Western blot檢測結(jié)果表明,空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、TCE致敏陰性組和TCE+CTSLi致敏陰性組中p-PKC蛋白的相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與其他各組相比，TCE致敏陽性組和TCE+CTSLi致敏陽性組的p-PKC的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與TCE致敏組相比，TCE+CTSLi致敏陽性組p-PKC蛋白相對(duì)表達(dá)有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,F=35.686)，見圖6。

3 討論

作為OMDT常見并發(fā)癥之一，TCE誘導(dǎo)的腎臟損害不僅會(huì)增加患者的治療難度，而且嚴(yán)重影響患者預(yù)后[5,12]。近年來，多項(xiàng)研究[8-9]提示CTSL在多種自身免疫性腎臟疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究表明藥理學(xué)抑制TCE致敏陽性小鼠腎臟CTSL的過表達(dá)后，腎臟損傷減輕，提示CTSL有望成為OMDT腎臟損害臨床治療的潛在作用靶點(diǎn)。本課題組既往研究提示CTSL可能是TCE致敏所致腎小球損傷重要參與者，本次研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，在TCE致敏陽性小鼠中腎臟過表達(dá)的CTSL與腎小球凋亡細(xì)胞水平呈正相關(guān)，抑制CTSL表達(dá)后，腎小球凋亡水平降低，提示過表達(dá)的CTSL可能是腎臟結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡的重要誘因之一。盡管病理學(xué)結(jié)果顯示致敏陽性小鼠腎小球細(xì)胞的損害，然而過表達(dá)的CTSL是否破壞腎小球屏障結(jié)構(gòu)還有待探究。

圖6 不同組別小鼠腎臟PKC、p-PKC蛋白表達(dá)

雖然本研究發(fā)現(xiàn)CTSL主要表達(dá)于TCE致敏小鼠受損的腎小球，但是通過藥理學(xué)抑制CTSL的表達(dá)后， TCE致敏所致的腎小管損傷同樣有所減輕。課題組推測，CTSL可能是TCE致敏所致腎損傷中腎小球和腎小管對(duì)話的一個(gè)關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)。腎小球-腎小管之間存在廣泛的生物信息聯(lián)系，存在許多共同的信號(hào)通路的參與，其串?dāng)_逐漸引起了廣泛關(guān)注。由于球-管的特殊生理結(jié)構(gòu)，腎小球分泌的包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、血管生成素-1、炎癥因子在內(nèi)的多種生物信息因子可通過旁分泌等途徑作用于腎小管上皮細(xì)胞，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生不同程度的改變[13]。另一方面，腎小管炎癥反應(yīng)同樣可以反過來損害腎小球的濾過功能，導(dǎo)致腎功能的下降。腎小球-腎小管的這種交互作用于信息傳遞在維系正常腎臟結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用，這種正常的生物信息傳遞的破壞也是多種腎臟疾病發(fā)病的分子機(jī)制。

慢性腎病的體外研究[14]表明細(xì)胞內(nèi)白蛋白的超載可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和激活PKC/p38 MAPK通路，介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。此外，PKC還是導(dǎo)致蛋白尿形成的關(guān)鍵分子，尿蛋白等生物大分子的過度運(yùn)輸不僅可加重腎小管負(fù)載，還可加重腎小管間質(zhì)炎性損傷以及誘導(dǎo)RTECs凋亡。研究[15]顯示藥理學(xué)抑制PKC過表達(dá)可通過降低蛋白尿的生成，從而減輕腎小管負(fù)載和腎小管細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本課題組前期研究[16]表明CTSL可通過切割補(bǔ)體C3，同時(shí)還可激活p38 MAPK和NF-κB通路。由此可見，PKC信號(hào)在串聯(lián)腎小球-腎小管結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究中，蛋白免疫印跡結(jié)果顯示TCE致敏陽性小鼠腎臟中PKC磷酸化水平明顯升高，而CTSLi的預(yù)處理降低其表達(dá)。因此，推測在TCE致敏腎損害過程中，PKC可能是CTSL介導(dǎo)TCE所致腎小球和腎小管的損害過程中的一個(gè)關(guān)鍵作用分子。

綜上所述，在TCE致敏過程中，過表達(dá)的CTSL可以通過激活PKC信號(hào)通路，誘導(dǎo)腎小球細(xì)胞和腎小管細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)腎臟損害。藥理性抑制CTSL的過表達(dá)可以明顯改善TCE致敏所致小鼠腎臟損害，有望成為治療OMDT腎臟損傷的潛在靶點(diǎn)之一。