衛(wèi) 霞，宋育林，涂倩倩，徐 魁

在中國，土三七等中草藥是肝竇阻塞綜合征(hepatic sinusoidal obstruction syndrome,HSOS)的主要致病因素[1]。HSOS確切的發(fā)病機制不明，目前認為谷胱甘肽(glutathione,GSH)耗竭[2]、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)[3]等均與其相關(guān)。白藜蘆醇(resveratrol，RES)是一種多酚類物質(zhì)，多種植物中存在，被認為是沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)的一種有效的激活劑[4]，具有激活SIRT1、抗氧化、抗炎等多個方面的作用[4-5]，并在多種肝臟疾病中具有保護肝臟作用[5]。白藜蘆醇被證實能夠通過抑制HIF-1α/VEGF信號通路來減輕肝臟缺損再灌注損傷[6]，但其在HSOS的發(fā)病過程中能否發(fā)揮作用目前尚未可知。為此，本研究通過建立野百合堿(monocrotaline,MCT)導致的HSOS大鼠模型，探討對白藜蘆醇對MCT所致的大鼠HSOS的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物32只健康雄性Sprauge-Dawley(SD)大鼠，等級：SPF級，6周齡，重量(210±30)g，購于北京斯貝福公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010。

1.2 主要實驗試劑及儀器野百合堿、白藜蘆醇均購自美國MCE制藥有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測試劑盒為羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司生產(chǎn)，總膽紅素(total bilirubin,TBiL)檢測試劑盒為上海科華生物工程股份有限公司產(chǎn)品；GSH試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒均為南京建成生物工程研究所制造；SIRT1、HIF-1α、VEGF、GAPDH抗體均購自合肥朵能生物科技有限公司(貨號：AB0208501、AB0146701、AB013301、AB010301)；二抗系Proteintech公司產(chǎn)品[山羊抗小鼠二抗貨號：SA00001-1；山羊抗兔二抗貨號：SA00001-2]。Roche Cobas 8000全自動生化分析儀購自瑞士Roche公司；酶標儀產(chǎn)自美國Thermo公司；紫外可見分光光度計購于上海菁華公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自Solarbio公司；垂直、轉(zhuǎn)移電泳槽均購于上海天能公司；化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)ZF-670產(chǎn)自上海嘉鵬公司。

1.3 實驗方法32只雄性SD大鼠隨機分為三組：對照(Control)組8只、野百合堿(MCT)組12只，白藜蘆醇(RES)組12只。MCT組和RES組均給予MCT 160 mg/kg單次灌胃，對照組給予相應(yīng)劑量的溶劑灌胃處理，RES組于灌胃前1 d起每天予以RES溶液30 mg/kg腹腔注射給藥；對照組和MCT組予以相應(yīng)劑量的溶劑進行相同處理。所有大鼠在行MCT灌胃處理2 d后處死。處死前予以隔夜禁食，稱重后麻醉處理，再腹主動脈采血和取出肝臟。全血室溫下靜置2 h后離心，提取上層血清-80 ℃冰箱凍存。肝臟取出后稱量肝濕重，計算肝指數(shù)(%)=(肝臟濕重/處死前大鼠體質(zhì)量)×100%，10%福爾馬林緩沖液固定的部分肝左葉留做病理學檢查，余肝臟組織于液氮中暫存，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱貯存。

1.4 肝功能指標檢測全自動生化分析儀檢測大鼠血清ALT、AST、TBiL水平。

1.5 肝組織勻漿檢測GSH、MDA含量剪取一定量的肝組織，洗滌干凈后每克組織加入9ml的0.9%氯化鈉溶液，冰浴條件下制備10%肝組織勻漿，離心后提取上清液，-20 ℃冰箱保存待測。按照試劑盒說明書步驟操作，分別采用微板法和硫代巴比妥酸法檢測GSH和MDA，考馬斯亮蘭法測定肝組織總蛋白。

1.6 HE、Masson染色觀察肝組織形態(tài)經(jīng)福爾馬林固定的肝組織經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、切片后按步驟行HE和Masson染色。于電子顯微鏡下觀察并拍照，按Dleve[7]病理評分標準打分，根據(jù)各項積分之和分為輕、中、重度HSOS。

1.7 蛋白免疫印記法檢測肝組織中SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達水平取部分大鼠肝組織勻漿，離心，提取總蛋白，后按步驟行凝膠電泳，再經(jīng)電轉(zhuǎn)與封閉，一抗及相應(yīng)濃度分別為：SIRT1抗體(1 ∶250)、HIF-1α抗體(1 ∶250)、VEGF抗體(1 ∶200)。4 ℃環(huán)境下孵育過夜，二抗于室溫下孵育2 h，以GAPDH(1 ∶2 000)作為此次實驗的內(nèi)參，使用化學發(fā)光儀顯影，Image J軟件分析所獲得的數(shù)據(jù),結(jié)果以光密度值比值(目的蛋白/內(nèi)參蛋白)形式表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況及肝指數(shù)變化在實驗期間，與Control組大鼠相比，MCT組和RES組大鼠逐漸出現(xiàn)不同程度的食欲減退、行動緩慢、毛色暗淡、反應(yīng)遲鈍，解剖后可見腸道淤血水腫及腹腔積液，且MCT組大鼠較RES組整體情況更差，至實驗結(jié)束，各組均無大鼠死亡。MCT組大鼠處死前體質(zhì)量、肝濕重及肝指數(shù)較Control組均有所增加(P<0.01)，RES組三種指標均較MCT組有所減少(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠重量情況變化

2.2 各組大鼠血清肝功能變化與Control組相比，MCT組大鼠ALT、AST、TBiL均有所升高(均P<0.01)，而在使用RES干預后各指標均有降低(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠各組大鼠血清ALT、AST、TBiL變化

2.3 各組大鼠肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標GSH、MDA的變化與Control組相比，MCT處理后大鼠肝臟組織中GSH下降，MDA上升(均P<0.01)。使用白藜蘆醇干預后GSH水平提高，MDA水平降低(均P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠肝組織GSH、MDA變化

2.4 各組大鼠肝臟病理損傷變化Control組大鼠肝臟HE和Masson染色所見結(jié)構(gòu)符合正常大鼠肝臟病理表現(xiàn)，肝小葉結(jié)構(gòu)完整。MCT組大鼠可見肝竇淤血擴張、中央靜脈內(nèi)皮損傷、內(nèi)皮下出血及膠原纖維沉積，肝細胞出現(xiàn)變性、壞死及排列紊亂。RES組大鼠肝臟病理變化較MCT組得到改善，本實驗表明使用白藜蘆醇處理能有效減輕HSOS的嚴重程度。見表4、圖1。

表4 各組大鼠肝組織病理評分

圖1 各組大鼠肝臟病理變化情況 HE染色和Masson染色 ×400

2.5 各組大鼠肝臟SIRT1、HIF-1α以及VEGF蛋白表達水平與Control組相比，MCT組大鼠肝臟SIRT1蛋白表達減少，而HIF-1α和VEGF蛋白的表達增加(均P<0.01)。與MCT組比較，RES組中，SIRT1蛋白增多，HIF-1α和VEGF蛋白含量減少。見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達情況

3 討論

HSOS是一種終末肝小靜脈閉塞性小靜脈炎，病理表現(xiàn)主要為肝竇和中央靜脈向心性、非血栓性阻塞，臨床表現(xiàn)與其他類型肝臟疾病相似，缺乏特異性[8]。中國引起HSOS的常見藥物有土三七等，其主要致病成分為吡咯里西啶生物堿(pyrrolizidine alkaloids,PAs)，PAs-HSOS在不同疾病階段具有不同的病理表現(xiàn)，最初可見肝竇Ⅲ區(qū)內(nèi)皮細胞損傷、壞死和脫落，并與血液中的紅、白細胞共同沉積于Disse腔隙，使小靜脈管壁增厚，管腔變窄和閉塞，又被稱為肝小靜脈閉塞癥，后期大量細胞外基質(zhì)沉積，引起肝血竇和小靜脈的膠原纖維化[2]。關(guān)于PAs-HSOS動物模型的建立，目前最常用的方法為MCT 160 mg/kg單次灌胃法[9]。該實驗中，采用MCT 160 mg/kg單次灌胃后檢測大鼠血清肝功能指標異常，肝臟病理出現(xiàn)細胞排列紊亂，其間伴有變性、壞死，肝竇出現(xiàn)淤血擴張，合并有中央靜脈內(nèi)皮損傷，與文獻[9]報道的損傷表現(xiàn)相符，表明本實驗成功復制出MCT誘導的大鼠HSOS模型。

VEGF與細胞表面受體結(jié)合后發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的通透性的作用，并有利于內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和存活[10]。在使用土三七造模的小鼠實驗中，可以觀察到VEGF蛋白和mRNA表達水平較正常組均有所提高[3]，該實驗中，MCT組大鼠VEGF表達含量較Control組增加，說明VEGF參與PAs-HSOS發(fā)病過程。Mizrahi et al[11]的實驗觀察到使用人源化的VEGF單克隆抗體-貝伐單抗干預，可以減輕奧沙利鉑誘導的肝竇內(nèi)皮細胞損傷，提示抑制VEGF可能對HSOS具有保護作用。

SIRT1主要存在于細胞核中，在體內(nèi)廣泛表達，通過去乙?；鞣N組蛋白/非組蛋白的賴氨酸殘基來調(diào)控多種基因表達，做為SIRT1激動劑，白藜蘆醇能夠在體內(nèi)環(huán)境中促進SIRT1與底物分子結(jié)合，從而增強其去乙酰化能力[12]。SIRT1能夠在Lys709位置上去乙?；种艸IF-1α的表達，使HIF-1α去乙?；Щ睿瑥亩鴧⑴c調(diào)控氧化應(yīng)激、細胞凋亡、能量代謝等多個過程，發(fā)揮其重要作用[13]?；钚訦IF-1α分子能夠激活VEGF并使其穩(wěn)定表達，在血管形成的過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[14]。在一項缺血再灌注性肝損傷研究[6]中，于再灌注前30 min對大鼠行白藜蘆醇預處理，觀察到HIF-1α、VEGF的表達被抑制，結(jié)合血清學指標檢測及病理學觀察大鼠肝損傷得到改善。該實驗中，白藜蘆醇組大鼠的SIRT1表達水平較MCT組提高，同時HIF-1α和VEGF的表達減少，大鼠肝功能損傷指標有所好轉(zhuǎn)，病理損傷程度改善，說明白藜蘆醇能夠通過上調(diào)SIRT1的表達，抑制HIF-1α/VEGF信號通路對MCT所致的HSOS起保護作用。

目前認為PAs經(jīng)胃腸道吸收后主要被肝臟內(nèi)細胞色素P40酶系代謝，其代謝產(chǎn)物與GSH結(jié)合后解毒，或蛋白質(zhì)反應(yīng)生成毒性吡咯蛋白加合物；肝竇內(nèi)皮細胞內(nèi)的GSH含量較低，容易受到反映性代謝產(chǎn)物的影響，導致GSH嚴重消耗和吡咯蛋白加合物生成增加[2]。在該實驗中，野百合堿處理后大鼠肝組織勻漿檢測GSH較Control組降低，MDA升高，說明GSH不足引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷是HSOS的重要發(fā)病機制。通過抑制氧化應(yīng)激損傷，提升肝細胞內(nèi)的GSH水平能夠有效減輕野百合堿誘導的HSOS[15]。該實驗發(fā)現(xiàn)，在使用白藜蘆醇干預后，肝功能損傷相關(guān)指標下降，大鼠肝組織GSH水平提高，MDA降低，HSOS病理學評分也有所改善，說明白藜蘆醇可以通過升高肝臟GSH水平、減少MDA的表達，保護野百合堿引起的肝損傷。

綜上，本研究表明，白藜蘆醇能夠通過增加SIRT1的表達，抑制HIF-1α/VEGF信號通路及抗氧化應(yīng)激損傷來保護MCT引起的大鼠肝損傷，這將為有效防治含PAs的中草藥引起的肝損傷提供重要的理論依據(jù)和治療靶點。