楊潔真，王 晶，宋永紅，唐 勤，吳 強(qiáng),3

卵巢癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，其病死率位居女性惡性腫瘤第五位[1]。導(dǎo)致卵巢癌病死率較高的主要原因之一是腫瘤復(fù)發(fā)后對(duì)化療藥物的耐藥，耐藥不僅限制了卵巢癌復(fù)發(fā)患者的二次手術(shù)機(jī)會(huì)，對(duì)晚期卵巢癌的初次減瘤手術(shù)也有較大的影響，因此尋找降低卵巢癌化療耐藥性的治療方案是目前研究熱點(diǎn)之一[2-3]。中藥有效成分聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物，能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)一線化療藥物的耐藥程度[4]。莪術(shù)醇是衡量中藥莪術(shù)油藥效的重要指標(biāo)之一，課題組前期利用脂質(zhì)體運(yùn)載莪術(shù)醇，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體莪術(shù)醇(liposome curcumol, LC)能有效發(fā)揮抗卵巢癌作用[5]，并且與順鉑聯(lián)合使用后能提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，促進(jìn)其凋亡[6]。但是LC是否能夠降低卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥程度，目前未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3(上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司)；卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供; 脂質(zhì)體莪術(shù)醇(由合肥工業(yè)大學(xué)合成)；順鉑(D109812)、氯化銦(I196212)、二乙基二硫代氨基甲酸鈉(DDTC, S302932)(上海阿拉丁試劑有限公司)；乙腈(A955-4，美國(guó)ThermoFisher公司)；凋亡試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；利福平(沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司)；CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；β-actin(66009-1g)、Anti-P Glycoprotein(P-gp，22336-1-AP)(美國(guó)proteintech公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠、抗兔(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄和qPCR 試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；qRT-PCR引物(安徽通用生物股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)，SKOV3/DDP在常規(guī)培養(yǎng)基中加入200 ng/ml順鉑，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，使用前在無(wú)順鉑常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周。

1.2.1.1細(xì)胞分組 SKOV3/DDP細(xì)胞分成：① 空白對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)基；② 陰性對(duì)照組：含12.5 μg/ml脂質(zhì)體培養(yǎng)基；③ 順鉑組：含4 μg/ml順鉑的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；④ LC組：含20 μg/ml的LC培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；⑤ 聯(lián)合組：含順鉑(4 μg/ml)+LC(20 μg/ml)的培養(yǎng)基， 細(xì)胞先用含20 μg/ml的LC培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再與含順鉑(4 μg/ml)+LC(20 μg/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.2.1.2激動(dòng)劑分組 ① 利福平組：用培養(yǎng)基稀釋利福平粉末，配成10 μmol/L的溶液，培養(yǎng)細(xì)胞24 h；② 利福平+順鉑組: 用含利福平(10 μmol/L)+順鉑(4 μg/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；③ 利福平+LC組: 細(xì)胞先與含利福平(10 μmol/L)+LC(20 μg/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h, 再與20 μg/ml的LC培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；④ 利福平+LC+順鉑組: 細(xì)胞先與含20 μg/ml的LC+利福平(10 μmol/L)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h, 再與含LC(20 μg/ml)+順鉑(4 μg/ml))的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.2.2CCK-8法測(cè)細(xì)胞活力 在各組細(xì)胞中，加入CCK-8溶液10 μl/孔，37 ℃培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組-無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基組)/(對(duì)照組-無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基組)×100%。使用Graphpad回歸模型計(jì)算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.2.3液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)順鉑含量 各組取細(xì)胞沉淀，用超聲裂解后制備順鉑衍生物，細(xì)胞懸液加內(nèi)標(biāo)氯化銦，加5% DDTC溶液，45 ℃孵育20 min，加300 μl乙腈混勻，離心取上層溶液過(guò)濾，用HPLC-MS測(cè)定細(xì)胞內(nèi)順鉑平均含量(順鉑平均含量用順鉑衍生物與內(nèi)標(biāo)銦峰面積的比值/細(xì)胞數(shù)表示)。色譜柱：Thermo Syncronis C18柱(1 μm×2.1 mm×100 mm)；流動(dòng)相A相為乙腈，B相為0.1%甲酸水。質(zhì)譜條件：離子源：HESI源；噴霧電壓：4 000 V(+)；離子化模式：ESI+；毛細(xì)管溫度：320 ℃；掃面模式：選擇離子監(jiān)測(cè)SIM模式，鉑的衍生物：C15H29N3S6Pt ([M+H]+=639.04062)，內(nèi)標(biāo)銦的衍生物：C10H19N2S4In ([M+H]+=410.95426)。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 不含EDTA的胰酶消化、收集各組細(xì)胞后，加入400 μl的AnnexinV結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入5 μl AnnexinV染色液室溫避光孵育15 min，然后加入5 μl的碘化丙啶孵育5 min，最后使用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)樣本，用CytExpert軟件進(jìn)行分析。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)P-gp mRNA相對(duì)表達(dá)量 收集各組細(xì)胞，利用Trizol提RNA，使用諾唯贊逆轉(zhuǎn)錄試劑將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照qPCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行引物擴(kuò)增，最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt值進(jìn)行計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6Western blot檢測(cè)P-gp蛋白表達(dá)情況 提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，10% SDS-PAGE凝膠，200 mA、140 min轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉，加一抗P-gp(1 ∶1 000)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，加入二抗室溫孵育1.5 h，ECL進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，β-actin作為內(nèi)參，使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.7免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)P-gp蛋白表達(dá)情況 常規(guī)準(zhǔn)備細(xì)胞爬片，甲醛固定，用0.2% TxitonX-100處理5 min，3% H2O2處理5 min，加入一抗P-gp(1:400)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明后加封片劑封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用 Prism 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以表示。通過(guò)未配對(duì)的t檢驗(yàn)分析兩組之間的差異，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析及其兩兩比較方法LSD法，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑聯(lián)合LC對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞增殖的影響如圖1A所示，與不同濃度順鉑培養(yǎng)后，SKOV3/DDP的細(xì)胞活力(FSKOV3/DDP=220.6,IC50=28.36±2.71 μg/ml,P<0.05)高于SKOV3細(xì)胞(FSKOV3=573.0,IC50=7.64±0.58 μg/ml,P<0.05)。圖1B所示，與不同濃度LC培養(yǎng)后，SKOV3/DDP細(xì)胞活力呈濃度梯度依賴性降低(F=989.1,P<0.05)，IC50為(126.8±5.07)μg/ml，當(dāng)LC藥物濃度為20 μg/ml時(shí)，細(xì)胞活力值為90%以上，因此在后續(xù)研究中以LC藥物濃度20 μg/ml為標(biāo)準(zhǔn)。圖1C所示，與順鉑組相比，聯(lián)合組細(xì)胞活力呈順鉑濃度梯度依賴性地降低(F順鉑組=340.8vsF聯(lián)合組=363.7，P<0.05)，當(dāng)順鉑濃度為4 μg/ml時(shí)，聯(lián)合用藥能抑制SKOV3/DDP細(xì)胞的增殖(P<0.05)。圖1D提示，不同濃度的裸脂質(zhì)體對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞活力無(wú)明顯的抑制作用。

圖1 順鉑與LC聯(lián)合用藥對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞活力的影響

2.2 LC對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞內(nèi)順鉑平均含量的影響如表2所示，順鉑組和聯(lián)合組細(xì)胞內(nèi)順鉑平均含量呈時(shí)間梯度依賴性增高，聯(lián)合組細(xì)胞內(nèi)順鉑平均含量高于單用順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 順鉑組與聯(lián)合組在不同時(shí)間點(diǎn)SKOV3/DDP細(xì)胞內(nèi)的順鉑含量

2.3 順鉑與LC聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組(4.62%±1.32%)相比，順鉑組(23.11%±2.96%)和聯(lián)合組(54.34%±3.37%)凋亡率均增加，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率在四組中最高(F=242.0，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 順鉑與LC聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.4 LC通過(guò)抑制P-gp蛋白表達(dá)逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性如圖3A所示，與SKOV3相比，SKOV3/DDP細(xì)胞中P-gp蛋白表達(dá)水平上升(t=14.08,P<0.05)。如圖3B所示，LC作用48 h能抑制SKOV3/DDP細(xì)胞中P-gp蛋白的表達(dá)量(F=80.46,P<0.05)。如圖3C和D所示，與順鉑組相比，聯(lián)合用藥組P-gp mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平下降(FmRNA=115.5,F蛋白=258.4,P<0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥能抑制P-gp蛋白在SKOV3/DDP細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜中的表達(dá)(圖3E)。

圖3 LC通過(guò)抑制P-gp蛋白表達(dá)逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細(xì)胞的順鉑耐藥

2.5 P-gp活性激動(dòng)劑可逆轉(zhuǎn)LC介導(dǎo)的P-gp蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果提示，P-gp活性激動(dòng)劑利福平能促進(jìn)SKOV3/DDP細(xì)胞中P-gp蛋白的表達(dá)，并部分恢復(fù)聯(lián)合用藥后SKOV3/DDP細(xì)胞P-gp蛋白的表達(dá) (F=41.43,P<0.05)。

3 討論

卵巢癌的發(fā)病率大約在5%，但其病死率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位[1]。在卵巢癌臨床治療中，化療藥物的使用顯著延長(zhǎng)了腫瘤患者的生存年限[7]。然而，化療耐藥的出現(xiàn)嚴(yán)重制約了化療的效果，甚至導(dǎo)致治療的失敗。因此，如何逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥成為改善卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在本研究中，以前期研究為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體莪術(shù)醇聯(lián)合順鉑可明顯降低卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP細(xì)胞活力，促進(jìn)凋亡，降低細(xì)胞中P-gp蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)SKOV3/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)作為耐藥機(jī)制中最常見(jiàn)的原因之一，主要涉及腺苷三磷酸(ATP)結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP-binding cassette, ABC)超家族，其能將多種物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，保護(hù)機(jī)體免受有毒代謝物和化合物的傷害。ABC外排轉(zhuǎn)運(yùn)體在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)能夠限制化療藥物的長(zhǎng)期有效使用，形成MDR[8]。P-gp是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B亞族，為MDR1的表達(dá)產(chǎn)物?；熀螅[瘤細(xì)胞內(nèi)P-gp表達(dá)升高，其通過(guò)與化療藥物結(jié)合，由ATP供能將細(xì)胞內(nèi)藥物泵出細(xì)胞外，促使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而產(chǎn)生耐藥[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞中，相比于SKOV3，SKOV3/DDP中的 P-gp 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。聯(lián)合用藥組P-gp的mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)。這與Gao et al[9]研究一致，P-gp在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)水平與腫瘤的多藥耐藥呈正相關(guān)，P-gp促進(jìn)細(xì)胞將各種化療藥物外排導(dǎo)致卵巢癌患者的多藥耐藥。

大量研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇作為中藥莪術(shù)揮發(fā)油中提取的有效單體成分，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤作用[10]，當(dāng)與化療藥物聯(lián)用時(shí)，可增強(qiáng)化療療效并對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷作用[11]。Huang et al[12]研究表明，莪術(shù)醇可通過(guò)抑制PI3K/AKT通路激活，提高人胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。莪術(shù)醇通過(guò)靶向miR-181b-2-3p-ABCC3軸抑制三陰性乳腺癌增長(zhǎng)，增強(qiáng)其對(duì)阿霉素的敏感性[13]。課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，LC可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路激活，進(jìn)一步增強(qiáng)順鉑抗卵巢癌作用，并降低順鉑的IC50。在本研究中，通過(guò)HPLC-MS檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)順鉑平均含量[14]，發(fā)現(xiàn)順鉑聯(lián)合LC用藥促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)順鉑平均含量的增高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LC作用48 h對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的P-gp表達(dá)抑制效果最佳，但是臨床順鉑常用一日方案，因此我們?cè)谠O(shè)計(jì)聯(lián)合用藥方案時(shí)，將 LC與細(xì)胞先培養(yǎng)24 h后，再與順鉑聯(lián)合作用24 h，這為藥物將來(lái)的臨床轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。

圖4 P-gp活性激動(dòng)劑(利福平)影響LC抑制SKOV3/DDP細(xì)胞P-gp蛋白的表達(dá)量

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)順鉑與LC聯(lián)合用藥能增強(qiáng)SKOV3/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性，該作用可能與抑制P-gp蛋白表達(dá)、增加細(xì)胞內(nèi)順鉑的藥物平均含量有關(guān)。該研究為耐藥卵巢癌的治療提供新的思路，但是聯(lián)合用藥降低卵巢癌對(duì)順鉑耐藥的機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。