李華玲，楊 迪，韋俊杰，陳章悅，陳菊萍

人體衰老的本質(zhì)是細胞的衰老[1-2]，而衰老細胞的積累和癌癥、糖尿病和神經(jīng)退行性等疾病有關[3-4]。近年來發(fā)現(xiàn)有許多非編碼RNA影響著控制衰老的通路[5-6]，其表達水平在衰老的過程中發(fā)生了改變并發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。其中環(huán)狀RNA結構較線性RNA更穩(wěn)定，不會被核酸外切酶R所酶切，且有較強的組織表達特異性、時間和空間特異性以及疾病特異性，而環(huán)狀RNA在衰老過程中的作用研究較少。

本課題組前期采用基因芯片技術，在衰老細胞中發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0007113的下調(diào)明顯，其親本基因是泛素連接酶E3(HERC4)。HERC4 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種E3 泛素連接酶，參與肺癌、宮頸癌、乳腺癌等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[7-8]，對于其產(chǎn)生的環(huán)狀RNA 的研究更是鮮有報道。因此，本研究通過基因工程手段構建環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113的真核生物表達載體，經(jīng)過測序驗證正確后，利用脂質(zhì)體轉染試劑轉染人胚腎(HEK293T)上皮細胞，用qRT-PCR檢測hsa_circ_0007113的表達，并轉入人胚肺成纖維細胞IMR-90中，通過β-半乳糖苷酶染色和CCK-8檢測細胞的衰老程度和增殖程度，為深入了解該環(huán)狀RNA在衰老生物學中的功能提供了有力的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料HEK293T(人胚腎上皮細胞)、IMR-90(人胚肺成纖維細胞)為ATCC來源，購自南京科佰公司。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、Optium-Medium、雙抗(青霉素及鏈霉素)均購自美國Gibco公司。KOD Plus Neo購自日本TOYOBO，T4 DNA Ligase、FastDigest Enzyme 購自美國Thermo Scientific。Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell 購自北京TransGen Biotech。質(zhì)粒小量抽提試劑盒(E.Z.N.A.? Endo-free Plasmid Mini Kit I (50))、DNA膠回收試劑盒(E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit)購自美國Omega，TRIzol試劑、RnaseR純化試劑盒購自北京天根公司。逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒均購自南京諾唯贊公司。過表達載體pLC5-ciR試劑盒購自廣州吉賽生物公司。PCR 引物由上海生工合成。β-半乳糖苷酶檢測試劑盒、CCK-8試劑盒購自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1hsa_circ_0007113序列全長的擴增 從circBase數(shù)據(jù)庫(http：//www.circbase.org/)上查到環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113(circBank ID: hsa_circHERC4_012)的682 bp的全基因序列，引物序列為：(F) 5′-CCGAATTCAGATTGCTTGTGGACGAG CA-3′；(R)5′-TCCGGATCCAGGCCAAGCTGTCCAT CAGA-3′。(下劃線為EcoRI和BamHI的雙酶切位點，前邊為保護堿基)。以細胞的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR 反應體系 50 μl: 10×PCR buffer foe KOD-plus-neo 5 μl，KOD-plus-neo 1 μl，上、下游引物(10 μmol/L) 各1.5 μl，MgSO4(25 mmol/L) 5 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 32 μl。PCR擴增條件：95 ℃ 預變性5 min；98 ℃ 變性 10 s，58 ℃退火 30 s，68 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；68 ℃延伸5 min。得到PCR產(chǎn)物后用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，用DNA純化回收試劑盒回收目的片段。

1.2.2hsa_circ_0007113過表達載體的構建及鑒定 將回收的目的片段和pLC5-ciR載體分別用 EcoRⅤ、BamHI進行雙酶切，保持37 ℃、1 h，然后用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，并回收目的條帶。再用T4 DNA 連接酶連接目的片段和空載體質(zhì)粒，在EP管中配置連接反應液，用移液槍吹打混勻，保持22 ℃、30 min，然后16 ℃過夜連接，構建重組表達質(zhì)粒pLC5-ciR (+)hsa_circ_0007113。將連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞Trans1 T1，在 LB 固體培養(yǎng)基(氨芐)中培養(yǎng)、篩選，挑選陽性單菌落，接種于 LB 液體培養(yǎng)基(氨芐)，37 ℃搖床培養(yǎng)6 h，以菌液為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用較亮目的條帶的陽性菌液擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并進行雙酶切驗證，將成功切出目的條帶的菌液加甘油保菌后送上海生工生物有限公司測序。測序引物為F: 5′-ACCAAGGAAGGTGGAGTGTT-3′ ；R: 5′-AGGCCAA GCTGTCCATCAGA-3′。將測序結果正確的重組質(zhì)粒，用無內(nèi)毒素的質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3細胞轉染實驗 采用脂質(zhì)體轉染方法，將處于對數(shù)生長期的HEK293T或IMR90細胞接種到6孔板中，觀察細胞形態(tài)，待細胞覆蓋率約(70～90)%時，在100 ul 無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基中加入3 ug質(zhì)粒DNA，柔和混勻；在100 ul不含血清培養(yǎng)基中稀釋4 ul lipofectamine 2000轉染試劑，輕柔混勻，室溫放置5 min。二者混勻后靜置20 min，加入無血清培養(yǎng)基的細胞孔中，輕搖混勻，培養(yǎng)(5～6) h后，更換完全培養(yǎng)基后，37 ℃培養(yǎng)待檢測。另外將空載體轉染組和未轉染組分別設置為陰性和陽性對照。

1.2.4實時熒光定量法檢測環(huán)狀RNA表達效果 收集轉染40 h后的細胞，以未經(jīng)轉染的細胞作為陰性對照組、轉染重組質(zhì)粒的細胞為過表達組，用TRIzol提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，反應條件為：30 ℃、10 min；42 ℃、20 min；95 ℃、5 min。逆轉錄使用隨機引物。以逆轉錄得到的cDNA為模板進行RT-qPCR，反應條件同前。

1.2.5β-半乳糖苷酶(SA-β-gal) 染色檢測細胞衰老 將轉染后培養(yǎng)40 h的IMR90細胞接種于新的6孔板，吸掉培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌后，加入SA-β-gal染色固定液1 ml/孔，室溫下靜置固定15 min；吸除細胞固定液，用PBS洗滌3 min，洗滌3次；加入1 ml/孔染色工作液，37 ℃過夜孵育；第二天在光學顯微鏡下觀察。藍綠色為陽性細胞，陰性細胞不被染色；各組在顯微鏡下選取3個視野，計數(shù)細胞總數(shù)和SA-β-gal染色陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比。

1.2.6細胞增殖率測定 轉染后培養(yǎng)40 h的IMR90細胞，以未經(jīng)轉染的細胞作為陰性對照組，以轉染重組質(zhì)粒的細胞為過表達組，稀釋成密度為每微升500個細胞，然后以每孔4 μl共2 000個細胞接種至96孔板內(nèi)，24 h后在光學顯微鏡下觀察細胞生長情況。去除原始培養(yǎng)液，每孔加入10 μl CCK-8溶液和90 μl DMEM培養(yǎng)液。在含5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育1 h，在450 nm處用酶標儀檢測吸光度值。

2 結果

2.1 環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113過表達載體的構建及鑒定根據(jù)hsa_circ_0007113(circBank ID: hsa_circHERC4)的全長682 bp序列，以EcoRI(GAATTC)和BamHI(GGATCC)雙酶切連接到修改的pLC5-ciR載體中，見圖1。

圖1 環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113 的全長序列及pLC5-ciR載體示意圖

通過PCR擴增了hsa_circ_0007113的全長序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段大小約682 bp左右。將構建的重組體PCR鑒定后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶大小正確的進行回收條帶并測序，測序峰圖正常，無雜峰或疊帶，進行測序分析后，陽性克隆測序結果顯示，插入的序列和預期目的基因序列完全一致，見圖2，紅框中為目的基因序列，藍框為部分成環(huán)框架序列(協(xié)助環(huán)狀RNA成環(huán))，說明成功構建重組的環(huán)狀RNA表達載體。

圖2 環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113 測序圖

2.2 環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113反向剪接的示意圖和測序鑒定環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113可以經(jīng)過反向剪接，使HERC4基因的19號外顯子5′末端連接到23號外顯子3′端而形成環(huán)狀結構。經(jīng)過測序后，結果進一步證實這一結論，箭頭左側為HERC4基因23號外顯子末尾序列，右側為19號外顯子的起始序列(圖3)。

2.3 環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113過表達效果檢測將重組體pLC5-ciR (+)hsa_circ_0007113 和空載體共轉染HEK 293T細胞40 h后，收集細胞提取總RNA，進行RT-PCR 擴增。結果表明，與對照組(pLC5)相比，過表達組的hsa_circ_0007113表達量明顯增高，表達量約為對照組的411倍，見圖4A、B，說明hsa_circ_0007113能在真核細胞中成功高效表達。

圖3 環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113 反向剪接位點經(jīng)sanger 測序驗證

2.4 環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113過表達的功能檢測

2.4.1過表達環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113對IMR-90細胞衰老的影響 pLC5-ciR (+)hsa_circ_0007113過表達組的β-gal染色陽性率為(32.6±0.031)%，而對照組陽性率是(46.1±0.071)%，見圖5，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明過表達環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113減輕細胞的衰老程度。

圖5 SA-β-gal 染色檢測過表達hsa_circ_0007113對IMR90細胞衰老的影響 SPX200

2.4.2過表達環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113對IMR-90細胞增殖的影響 pLC5-ciR (+)hsa_circ_0007113過表達組細胞CCK8檢測的OD值為(1.537±0.071)，與空白對照組(OD值0.687±0.050)比較，見圖6，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明pLC5-ciR (+)hsa_circ_0007113過表達組的細胞增殖活力高于對照組，hsa_circ_0007113對IMR-90 的增殖產(chǎn)生促進作用。

圖6 CCK8法檢測pLC5_circ_0007113過表達對IMR90細胞增殖的作用與對照組比較：*P<0.05

3 討論

蛋白酶體降解途徑在細胞周期和細胞免疫反應等眾多細胞過程中起著重要作用。不適當?shù)姆核亟閷У牡鞍踪|(zhì)降解與衰老也有密切關聯(lián)。USP 3是泛素特異性蛋白酶家族的成員之一。USP3 能夠去泛素化并穩(wěn)定 p53，同時促進正常細胞轉化[9]，有研究發(fā)現(xiàn)其環(huán)狀RNA，circUSP3的表達量與衰老有明顯聯(lián)系。還有報道發(fā)現(xiàn)一種 E3 泛素連接酶，Parkin具有潛在的抗衰老的作用[10]。E3泛素連接酶，能夠使一系列其底物蛋白泛素化并通過蛋白酶體進行降解，多年來的實驗研究發(fā)現(xiàn)可能正是由于E3泛素連接酶基因的突變或異常，導致其底物蛋白的非正常累積，對細胞產(chǎn)生極大的毒性，最終導致細胞的死亡，這可能是細胞衰老的原因之一，因此研究E3泛素連接酶HERC4及其所產(chǎn)生的環(huán)狀RNA的性質(zhì)對于揭秘衰老有著重要的意義。

目前，對于泛素連接酶HERC4 所產(chǎn)生的環(huán)狀RNA 僅被檢測出，并沒有詳細報道，因此本文在實驗室的前期Arraystar 芯片篩選的與衰老相關的環(huán)狀RNA中，最先關注了來源于HERC4基因的環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113，同時研究分析了環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113的基本特征以及成功構建了hsa_circ_0007113的過表達載體。通過數(shù)據(jù)庫比對，hsa_circ_0007113是由HERC4( NM_022079)的19、20、21、22、23號外顯子經(jīng)過反向剪接而成，剪切點前后的序列分別是AG和GT，這正符合環(huán)狀RNA產(chǎn)生的剪切規(guī)律。經(jīng)過對hsa_circ_0007113反向剪切位點的測序驗證，說明hsa_circ_0007113確實首尾相接(首AGCAGGTTCGTTG、 尾GCAGGTGTTCG)，成環(huán)正確。經(jīng)過對 hsa_circ_0007113 全長序列的擴增及測序驗證，說明成功構建了過表達的環(huán)狀RNA，pLC5-ciR (+)hsa_circ_0007113，并在HEK293T 細胞中高效表達。

在確定hsa_circ_0007113 成功過表達后，本研究進一步通過轉染將hsa_circ_0007113過表達載體和空載體轉染至IMR90細胞中，研究其對細胞的衰老過程和增殖的影響，結果顯示，過表達hsa_circ_0007113后，細胞的增殖增加，抑制了衰老。

近年來，在多種組織和細胞系中發(fā)現(xiàn)了許多的環(huán)狀RNA，而對于 circRNA 的研究熱點主要集中在腫瘤領域[11-12]，在衰老及衰老引起的疾病中的研究較少，目前僅有少量與衰老相關的環(huán)狀RNA的研究，如Circ-Foxo3、CircPVT1 CircCCNB1 在衰老的過程中發(fā)揮一定的調(diào)控作用[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)了一個來源于HERC4 基因的環(huán)狀RNA 的新的功能，在人肺成纖維細胞中進行了功能驗證，并證實了其與衰老的關系，其具體分子機制有待進一步探討。環(huán)狀RNA 的作用機制，目前最常見的是作為“miRNA海綿”的吸附體，通過Ago2與miRNA競爭性結合，調(diào)控基因表達，經(jīng)過生物信息學分析，hsa_circ_0007113與 miRNA-515-3p、miRNA-519存在作用靶點(MREs)，而這2個miRNA是P53/P21衰老通路的重要因子，課題組將進一步研究其功能。

本研究首次將環(huán)狀RNA hsa_circ_0007113的序列連入pLC5真核表達載體，利用脂質(zhì)體轉染HEK293T細胞，成功地使pLC5-ciR (+)hsa_circ_0007113 在HEK 293T 細胞中轉錄表達，并在IMR90 細胞中進行了初步的功能驗證。證實了其與衰老的關系。因此，為后續(xù)研究hsa_circ_0007113 的功能和機制奠定了基礎。