董婷玉，郭夢慧，許昌勇，蔣海峰，張 磊，許 振，劉瀟一，嚴尚學，常 艷，魏 偉

下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPAA)由下丘腦、垂體、腎上腺組成，調(diào)節(jié)機體能量代謝，維護內(nèi)環(huán)境[1]。生理應(yīng)激時，下丘腦分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotrophin releasing hormone，CRH)，促進垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)，使腎上腺分泌糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)，GC又負反饋作用于下丘腦和垂體[2]。HPAA異常時，體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，如自身免疫病患者長期使用GC，腎上腺皮質(zhì)功能不全，皮質(zhì)醇缺乏，炎癥加重[3]。庫欣綜合征表現(xiàn)為HPAA亢進，皮質(zhì)醇分泌過多，誘發(fā)骨質(zhì)疏松和感染[4]。治療此類疾病多為恢復HPAA功能，因此對HPAA生理及病理反應(yīng)研究尤為重要。目前對HPAA的研究集中于嚙齒動物[5]或臨床病例分析[6]，也有對麋鹿[7]、水牛[8]、樹齁[9]等動物HPAA部分組織病理的特征觀察，對非人靈長類HPAA全面系統(tǒng)性的組織結(jié)構(gòu)特點卻鮮有報道。與其他動物相比，非人靈長類具有與人類相近的基因序列和神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)，是進行腦部研究最理想的實驗動物[10]。本研究探討了獼猴HPAA幾種病理切片的制作方法，對組織結(jié)構(gòu)做了詳細描述，為更好的模擬人類HPAA生理和病理特征提供了技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級實驗獼猴(雄性，年齡3～5歲)，由旌德縣皖南獼猴馴養(yǎng)繁殖基地提供[SCXK(皖)2020-001]，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所普通級猴飼養(yǎng)中心，濕度：(40～70)%；溫度：(21～26)℃；7:00 am～7:00 pm光照，自由攝取維持飼料和水，額外補充瓜、果、蔬、蛋、奶等食物來滿足獼猴的營養(yǎng)需要，嚴格按照動物倫理福利規(guī)定的標準開展實驗。所有實驗方案均經(jīng)安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所動物倫理委員會審查批準同意(批號：PT-2020-001)。

1.2 實驗試劑注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮(舒泰50)購自上海維克有限公司(批號：200826 12C BN 82T7A)安徽公司；DAPI染色液、Triton-X、EDTA抗原修復液購自北京Solarbio公司；DAB顯色試劑盒、通用型試劑盒(小鼠/兔聚合物法檢測系統(tǒng))購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蘇木精染液、HE染液套裝、抗熒光淬滅劑購自武漢Servicebio公司；兔抗CRH抗體、小鼠抗ACTH抗體、兔抗MAP2抗體購自美國Proteintech公司；兔抗GR抗體、兔抗ACTH-R抗體、兔抗CRFR1抗體購自美國Immunoway公司；兔抗iba-1抗體購自日本W(wǎng)ako公司；熒光標記山羊抗小鼠IgG AF 488購自武漢Elabscience Biotechnology公司；熒光標記山羊抗兔IgG AF 594購自美國Jackson公司。

1.3 實驗儀器組織脫水機購于湖北康龍電子科技有限責任公司；組織攤烤片機、包埋機購于湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；石蠟切片機、冰凍切片機購于Thermo Scientific公司；脫色搖床購于武漢Servicebio公司；恒溫烘箱購于上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；微波爐購于廣東Galanz公司；正置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、全自動免疫組化染色儀購于德國Leica公司。

1.4 獼猴下丘腦-垂體-腎上腺組織取材與保存在獼猴情緒平穩(wěn)的狀態(tài)下，按6 mg/kg肌肉注射鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮至深度麻醉，采用股動脈放血進行安樂死。在解剖臺上分離軀干和頭顱，去除頭部皮膚和附著肌肉，用電鋸從眉骨、顳骨、枕骨上方環(huán)狀鋸開，揭開顱頂骨和軟腦膜，暴露并剝離出大腦，冰上迅速取出下丘腦(圖1A)，從垂體窩中挑出垂體(圖1B)，同時打開腹部，于肝腎之間取出左、右腎上腺(圖1C)，固定于預冷4%多聚甲醛溶液(PFA)中。

1.5 獼猴下丘腦-垂體-腎上腺組織石蠟切片制作新鮮組織用4% PFA固定24 h以上，修剪目標組織，放入自動脫水機：70%、80%、90%、95%、100% Ⅰ、100%Ⅱ 乙醇各1 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 各30 min，55 ℃融化石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各1 h。從脫水盒內(nèi)取出組織放入包埋框內(nèi)，-20 ℃冷卻凝固，修齊表面后用切片機切片，厚4 μm，于攤片機40 ℃溫水上攤平，載玻片撈片，烘箱60 ℃烤干取出，室溫保存。

1.6 獼猴下丘腦組織冰凍切片制作4 ℃冰箱內(nèi)，新鮮組織用4% PFA固定24 h以上，轉(zhuǎn)入20%蔗糖溶液，沉底后換30%蔗糖溶液，再次沉底即可。脫水完成后取出，修齊組織，用OCT包埋劑將組織固定在樣本托上速凍，待OCT變白變硬即可進行切片。先粗切修齊組織面，再細切，厚度8～10 μm，粘附載玻片貼切片，-20 ℃保存。

1.7 獼猴下丘腦-垂體-腎上腺組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色石蠟切片首先經(jīng)60 ℃烘至蠟融化，而后二甲苯I、II各20 min，100%I、100%II、95%、85%、75%乙醇各5 min，流水沖洗進行脫蠟；蘇木精染色5～10 min，分化液分化20 s，返藍5 min，流水沖洗后85%、95%酒精各5 min，行伊紅染色3 min；最后經(jīng)75%、85%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ乙醇各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各20 min脫水，中性樹膠封片。

1.8 獼猴下丘腦-垂體-腎上腺免疫組織化學染色石蠟切片脫蠟后，經(jīng)0.5% Triton-X室溫30 min通透；用沸騰的EDTA抗原修復液余溫修復切片10 min；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫避光10 min；5% BSA室溫封閉1 h；滴加稀釋后的一抗：CRH、ACTH、CRFR1(1 ∶100)；ACTH-R(1 ∶200)；GR(1 ∶50)，濕盒內(nèi)4 ℃過夜；次日拿出切片復溫，洗去一抗，滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗，室溫20 min；滴加新配制的DAB顯色液，鏡下控制顯色時間，流水沖洗終止顯色；蘇木素染色20 s，分化，返藍，流水沖洗后脫水封片。

1.9 獼猴下丘腦組織石蠟切片免疫熒光染色切片同上述方法脫蠟、通透、抗原修復、封閉后，滴加稀釋的一抗：iba-1(1 ∶500)、MAP2(1 ∶100)，濕盒4 ℃過夜；第二日拿出切片復溫，洗去一抗，滴加與一抗相應(yīng)種屬的熒光二抗，室溫避光1 h后DAPI染液室溫避光10 min染細胞核；自發(fā)熒光淬滅劑室溫避光5 min；抗熒光淬滅封片劑封片，蓋玻片四角用中性樹膠固定，4 ℃避光保存。切片于激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.10 獼猴下丘腦組織冰凍切片免疫熒光染色冰凍切片于37 ℃ 、(10～20) min，4% PFA固定30 min后，用5% BSA和0.5% Triton-X混合液室溫封閉通透1 h；而后同上述1.9的方法進行一抗、二抗敷育、DAPI染核、淬滅組織熒光、封片、鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 獼猴下丘腦、垂體、腎上腺組織解剖形態(tài)學觀察從腦底面觀，下丘腦位于丘腦溝以下，前方是視交叉，呈現(xiàn)中空漏斗狀，重量約為2 g，主要包括乳頭體、結(jié)節(jié)部和視上部(圖1A、B)。揭開全腦，斷開視交叉，可見垂體陷于顱骨蝶鞍垂體窩內(nèi)，剝離硬腦膜，挑出垂體，形似直徑5 mm的碗豆狀結(jié)構(gòu)(圖1C、D)。腎上腺左右各一，位于兩側(cè)腎臟的上方，被腎筋膜和脂肪組織所包裹，左腎上腺稍大，如半月形，右腎上腺稍短，為錐形(圖1E、F)。

圖1 獼猴下丘腦、垂體、腎上腺組織解剖形態(tài)學

2.2 獼猴下丘腦、垂體、腎上腺組織病理切片HE染色

2.2.1下丘腦組織病理切片HE染色 主要分布著神經(jīng)元細胞和小膠質(zhì)細胞(圖2B▲)，正常神經(jīng)元胞體呈錐形，核大居中，胞質(zhì)中均勻分布強堿性尼氏體(圖2B黑色箭頭)，深色神經(jīng)元即壞死神經(jīng)元，細胞核固縮，胞體縮小變形，尼氏體消失不見，被增生的膠質(zhì)細胞吞噬(圖2C白色箭頭)。

2.2.2垂體組織病理切片HE染色 由腺垂體(anterior lobe)和神經(jīng)垂體(posterior lobe，PL)組成，兩部分之間界限清楚，腺垂體又可分為遠側(cè)部(pars distalis，PD)和中間部(pars intermedia，PI)(圖2D)；遠側(cè)部主要分布著嫌色細胞(圖2E黑色箭頭)、嗜酸性細胞(圖2E白色箭頭)及嗜堿性細胞(圖2E▲)，細胞集合成團索狀；中間部(圖2F*)是位于遠側(cè)部與神經(jīng)垂體之間的狹窄部分，主要分布嗜堿性細胞和嫌色細胞；神經(jīng)垂體主要由無髓神經(jīng)纖維和神經(jīng)膠質(zhì)細胞組成，也縱橫毛細血管，高倍鏡下神經(jīng)垂體內(nèi)的嗜酸性團塊為神經(jīng)軸突內(nèi)的分泌物，稱為赫令體(圖2G黑色箭頭)。

2.2.3腎上腺組織病理切片HE染色 由周邊皮質(zhì)和中央髓質(zhì)(medulla，M)構(gòu)成，表面包以結(jié)締組織被膜(capsule，C)，皮質(zhì)由外向內(nèi)分別為球狀帶(zona glomerulosa，ZG)、束狀帶(zona fasciculata，ZF)和網(wǎng)狀帶(zona reticularis，ZR)(圖2H)；球狀帶較薄，細胞為卵圓形，胞質(zhì)少，核深染呈球形，細胞排列成球狀，團塊或拱形(圖2I)。束狀帶位于球狀帶深面，是皮質(zhì)中最厚的部分，細胞大，多邊形，部分有雙核，核圓形，染色淡，胞質(zhì)有嗜酸性大脂滴，細胞排列成束，呈放射狀伸向髓質(zhì)(圖2J)；網(wǎng)狀帶細胞相互排列成網(wǎng)，胞漿少，內(nèi)含脂褐素和脂滴，核深染(圖2K)；髓質(zhì)由排列成團的髓質(zhì)細胞、結(jié)締組織和大量血竇組成，胞體較大，呈卵圓形(圖2L)。

圖2 獼猴下丘腦、垂體、腎上腺組織HE染色圖

2.3 獼猴下丘腦、垂體、腎上腺免疫組織化學染色

2.3.1下丘腦組織病理切片免疫組化染色 圖3A是對下丘腦區(qū)域分泌的CRH進行免疫組化染色，可見下丘腦室旁核神經(jīng)元胞質(zhì)有棕黃色陽染；對CRH分泌起負反饋調(diào)節(jié)作用的糖皮質(zhì)激素受體(GR)多表達在細胞質(zhì)中，也有部分表達于細胞核，圖3B神經(jīng)元胞核中GR陽性顆粒明顯。

2.3.2垂體組織病理切片免疫組化染色 腺垂體合成釋放ACTH，圖3C中垂體嗜堿性細胞質(zhì)中充盈著陽染的ACTH黃色顆粒；接受下丘腦釋放的CRH的CRHR1表達于胞膜(圖3D)；GR主要位于垂體中間部細胞核和細胞質(zhì)中(圖3E)。

圖3 獼猴下丘腦、垂體、腎上腺免疫組織化學染色圖 ×400A：下丘腦CRH染色；B：下丘腦GR染色；C：垂體ACTH染色；D：垂體CRHR1染色；E：垂體GR染色；F：腎上腺ACTHR染色

2.3.3腎上腺組織病理切片免疫組化染色 腺垂體釋放的ACTH與腎上腺皮質(zhì)束狀帶細胞上的ACTHR結(jié)合，如圖3F所示，ACTHR表達于胞膜上。

2.4 獼猴下丘腦免疫熒光染色圖4、圖5是對獼猴下丘腦區(qū)域離子鈣接頭蛋白1(ionized calcium binding adapter molecule 1，iba-1)和微管相關(guān)蛋白2(microtubule associated protein 2，MAP2)進行免疫熒光染色。從merge圖上可以清楚的觀察到iba-1在小膠質(zhì)細胞核中表達，MAP2在神經(jīng)元胞質(zhì)中表達。通過比較冰凍切片和石蠟切片的熒光染色效果，可以看出，腦組織石蠟切片在經(jīng)過脫水脫蠟等步驟后，組織中抗原的性質(zhì)易受到破壞，且操作過程較繁瑣，染片背景較深較雜，出現(xiàn)較多的非特異性染色，反觀冰凍切片染色圖，背景清晰明亮，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)易于辨認，效果優(yōu)于石蠟切片。

圖4 獼猴下丘腦iba-1免疫熒光染色圖 ×1 000

圖5 獼猴下丘腦MAP2免疫熒光染色圖 ×1 000

3 討論

HPAA作為“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫”(neuro-endocrine-immune，NEI)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的三大軸之一，當受到刺激時，大腦發(fā)出信號，以適應(yīng)環(huán)境。下丘腦最先接收到信息，興奮CRH神經(jīng)元，興奮投射至正中隆起，釋放CRH到垂體門脈系統(tǒng)到達垂體前葉，與CRH受體(CRHR1)結(jié)合，CRHR1是一種G蛋白偶聯(lián)受體，激活腺垂體ACTH生成細胞釋放ACTH入血到達腎上腺，與腎上腺皮質(zhì)束狀帶細胞上ACTH受體(ACTHR)結(jié)合，刺激其分泌GC(人類合成皮質(zhì)醇，嚙齒動物合成皮質(zhì)酮)[11]。皮質(zhì)醇進入體循環(huán)后，與分布于機體各組織器官的核受體GR結(jié)合，參與包括壓力反應(yīng)、糖代謝、炎癥反應(yīng)及情緒改變等多個調(diào)節(jié)過程[12]。皮質(zhì)醇又可與位于下丘腦及腺垂體上的GR結(jié)合，負反饋抑制CRH及ACTH的合成，其中任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生異常都會影響HPAA的功能，導致NEI網(wǎng)絡(luò)失調(diào)，對機體造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷[1]。該實驗以獼猴為實驗動物，探討了多種有效病理染色方法，系統(tǒng)性地研究HPAA各級組織器官的組織結(jié)構(gòu)學特征，并做了詳細描述，也檢測了各組織水平上分泌的激素及表達的激素受體，細化到了各蛋白的表達位置。其中iba-1是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細胞特異性標記蛋白，小膠質(zhì)細胞是腦固有巨噬細胞，在腦損傷時快速感測神經(jīng)障礙并被活化，遷移到損傷部位，發(fā)揮吞噬死細胞、產(chǎn)生促炎因子等功能[13]。MAP2存在于神經(jīng)元中，構(gòu)成細胞骨架，塑形神經(jīng)元，其缺失會導致神經(jīng)功能障礙[14]。這兩種蛋白的表達情況可以作為下丘腦神經(jīng)元發(fā)生炎癥病理損傷的評價指標。以上研究從組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學的角度更清晰直觀的表現(xiàn)出HPAA通過各激素和激素受體發(fā)揮調(diào)節(jié)機體內(nèi)環(huán)境的作用，為更好的模擬人類HPAA各環(huán)節(jié)的生理和病理特征提供了方法參考。

由于實驗時間限制，該研究只觀察了正常獼猴的HPAA組織形態(tài)學，接下來將聚焦到某一疾病模型，觀察病理狀態(tài)下的HPAA軸功能改變。