蔡 可，張晴晴，余文靜，薛楊央，汪 會，徐慧琴

放射治療是膠質(zhì)瘤術(shù)后的主要治療方法，然而，由于膠質(zhì)瘤高度缺氧和巨大異質(zhì)性常導致預后不良[1]。研究[2]表明，放射增敏劑是解決腫瘤放療耐受的有效手段之一。正電子發(fā)射計算機斷層顯像(positron emission computed tomography, PET/CT)在腫瘤診斷、分期及療效評價中應(yīng)用廣泛，目前采用標準化攝取值(standardized uptake value, SUV)進行分析，但SUV是半定量指標，易受到注射時間、患者體質(zhì)量、血糖水平等多種因素影響。全身動態(tài)18F-脫氧葡萄糖(fluorodeoxyglucose, FDG) PET/CT Patlak顯像具有傳統(tǒng)顯像無法獲得的FDG代謝的動力學信息，并且一次成像可生成多種類型PET圖像，如Patlak斜率Ki圖，Ki值代表FDG絕對攝取率，F(xiàn)DG絕對定量化有助于準確評估腫瘤治療效果，從而制定最佳治療方案以延長患者壽命[3-4]。本研究擬通過建立大鼠C6膠質(zhì)瘤模型，采用齊墩果酸(oleanolic acid，OA)對其進行放射增敏治療，探討全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像評價大鼠C6膠質(zhì)瘤放療增敏早期療效的價值。

1 材料與方法

1.1 細胞株與實驗試劑大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞由安徽醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院核醫(yī)學教研室提供；Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium, DMEM)高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶、磷酸鹽緩沖液均購自美國Gibco公司；齊墩果酸購自北京索萊寶科技有限公司；腫瘤增殖指數(shù)Ki-67及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(glucose transporter-1, GLUT-1)免疫組化試劑購自華安生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗動物24只雄性大鼠，SPF級，(4～5)周齡，體質(zhì)量(170～230) g，購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK(浙)2019-0001；所有實驗動物方案均獲安徽醫(yī)科大學動物實驗倫理審查委員會批準，批號：LLSC20211059。

1.3 實驗儀器VitalBeam直線加速器購自美國瓦里安公司；Biograph Vision PET/CT購自德國Siemens公司；18F-FDG購自江蘇南京江原安迪科正電子研究發(fā)展有限公司，放化純度>95%。

1.4 細胞培養(yǎng)與大鼠C6膠質(zhì)瘤模型建立大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，隔天換液，通常傳至2～3代。取處于對數(shù)生長期的C6膠質(zhì)瘤細胞，待細胞貼滿培養(yǎng)瓶底80%時用0.25%胰酶消化制成2.0×107/ml單細胞懸液，用1 ml無菌注射器抽取0.2 ml細胞懸液接種于大鼠右后肢皮下，記錄接種時間，約2周左右接種部位瘤體直徑≥1 cm時用于動物實驗。

1.5 實驗分組及處理將24只荷C6膠質(zhì)瘤大鼠按隨機數(shù)字表法分為以下4組，每組6只：對照組，給予生理鹽水灌服，2 ml/d/只，共7 d；OA組，給予20 mg/ml的OA生理鹽水懸濁液灌服，2 ml/d/只，共7 d；單純放療組，采用美國VARIAN Vitalbeam醫(yī)用直線加速器進行放療，照射采用6 Mev電子線，照射野10 cm×10 cm，源皮距100 cm，劑量率2 Gy/min，分次照射劑量4 Gy，隔日1次，共3次，累計照射劑量12 Gy；OA+放療組，放療前7 d每日給予OA生理鹽水懸濁液灌服，劑量同OA組，7 d完成所有給藥，隨后使用與單純放療組相同的參數(shù)進行放射治療。

1.6 全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像放療前及放療后48 h采用德國Siemens公司Biograph Vision PET/CT對四組荷C6膠質(zhì)瘤大鼠行75 min全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像，見圖1。大鼠顯像前夜禁食6 h，可自由飲水。用異氟烷麻醉大鼠并俯臥位固定于PET/CT檢查床上，先進行用于PET數(shù)據(jù)衰減校正的5 s低劑量CT采集(管電壓120 kV，管電流160 mA，螺距5.0 mm)，再移動檢查床于PET視野內(nèi)，經(jīng)大鼠尾靜脈彈丸式注射活度為37 MBq的18F-FDG，同時開始以心臟為中心的6 min動態(tài)單床PET采集，隨后在75 min內(nèi)進行18次連續(xù)進床全身PET掃描。采集完成后，采用有序子集最大期望值法(order subsets expectation maximization，OSEM)對原始動態(tài)PET數(shù)據(jù)(共46幀圖)進行重建(參數(shù)：迭代4、子集5，矩陣為128×128)。在重建好的PET圖像中勾畫左心室感興趣體積(volume of interest， VOI)，并將勾畫好的左心室VOI復制映射到同一斷層所有幀中，生成左心室時間-活度曲線(tumor time activity curve，TAC)。左心室TAC曲線作為輸入函數(shù)用于Patlak模型分析并獲得Ki圖像，動態(tài)PET圖像最后一幀作為測量SUV的圖像用于靜態(tài)分析，在SUV圖像中勾畫每只荷瘤大鼠的腫瘤感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，并將ROI復制到Ki圖中，測量每只荷瘤大鼠右后肢腫瘤SUVmax及Ki值。4組荷瘤大鼠腫瘤體積由PET/CT系統(tǒng)自帶軟件True D計算測量。

圖1 全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像流程圖

1.7 病理學檢查顯像完成后，迅速取出腫瘤組織，用體積分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm切片行Ki-67及GLUT-1免疫組織化學檢查。在高倍視野下(×400)，從每張切片隨機選擇5個視野進行拍照分析，計算每個視野100個細胞中的陽性細胞百分比。

2 結(jié)果

2.1 全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像結(jié)果接種2周左右，24只大鼠右后肢均可見類圓形瘤體組織，接種成功率100%。18F-FDG PET/CT顯像荷瘤大鼠右后肢均可見不同程度放射性攝取增高灶，少數(shù)腫瘤放射性分布欠均勻。治療前，4組SUVmax、Ki值差異無統(tǒng)計學意義(FSUVmax=0.909，P>0.05；FKi=0.858，P>0.05)；治療后48 h，4組之間SUVmax、Ki值差異有統(tǒng)計學意義(FSUVmax=68.547，P<0.01；FKi=200.648，P<0.01)，對照組、OA組的SUVmax、Ki值較治療前升高(tSUVmax=-10.697，P<0.01、tKi=-17.516，P<0.01；tSUVmax=-19.321，P<0.01、tKi=-9.887，P<0.01)，放療組、OA+放療組的SUVmax、Ki值較治療前下降(tSUVmax=5.629，P<0.01、tKi=6.916，P<0.01；tSUVmax=7.241，P<0.01、tKi=10.490，P<0.01)。治療后放療組、OA+放療組的SUVmax差異無統(tǒng)計學意義(t=1.233，P=0.246)，而OA+放療組的Ki值較放療組降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.051，P<0.05)，見表1、圖2。治療前4組腫瘤體積差異無統(tǒng)計學意義(F=0.507，P>0.05)。治療后48 h，4組腫瘤體積差異有統(tǒng)計學意義(F=432.386，P<0.01)，對照組、OA組腫瘤體積較治療前明顯增大，放療組、OA+放療組腫瘤體積增長緩慢，而放療組、OA+放療組腫瘤體積組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.707，P>0.05)，見表1。

圖2 治療后48 h 4組大鼠全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像圖A：對照組；B：OA組；C：單純放療組；D：OA+放療組

表1 各組大鼠治療前后腫瘤SUVmax、Ki值及腫瘤體積變化

2.2 免疫組化結(jié)果鏡下觀察，Ki-67陽性表達于細胞核，部分表達于細胞質(zhì)中，4組陽性細胞百分比分別為(59.19±4.27)%、(60.14±5.24)%、(40.76±3.61)%和(31.77±3.87)%，OA+放療組陽性細胞百分比低于其他3組(F=63.887，t=11.657、10.662、4.161，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；GLUT-1陽性表達于細胞膜，部分表達于細胞質(zhì)中，4組陽性細胞百分比分別為(74.53±5.66)%、(75.40±5.07)%、(53.21±9.11)%和(41.87±4.45)%，OA+放療組陽性細胞百分比顯著低于其他3組(F=40.720，t=11.116、12.173、2.743，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，見圖3。

圖3 各組荷C6膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤組織Ki-67及GLUT-1免疫組織化結(jié)果EnVision ×400

2.3 Ki-67及GLUT-1表達與Ki值之間的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示Ki-67及GLUT-1表達與Ki值均呈正相關(guān)(rKi-67=0.931，P<0.01;rGLUT-1=0.936，P<0.01)，見圖4。

圖4 Ki值與Ki-67及GLUT-1表達相關(guān)性分析A：Ki值與Ki-67表達相關(guān)分析圖；B：Ki值與GLUT-1表達相關(guān)分析圖

2.4 Kaplan-Meier法分析荷瘤鼠生存情況對照組、OA組、單純放療組、OA+放療組的生存時間分別為(43.00±7.97)天、(44.83±6.21)天、(52.00±3.10)天及(57.67±3.27)天，Kaplan-Meier法分析顯示各組間生存時間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.817，P<0.01)，見圖5。

圖5 Kaplan-Meier法分析4組荷瘤鼠生存率

3 討論

惡性腫瘤的診斷及早期療效評價與患者預后密切相關(guān)，準確的療效評估對患者來說至關(guān)重要。PET/CT廣泛用于監(jiān)測腫瘤組織代謝、增殖、乏氧及凋亡等情況，可特異性地從分子水平反映腫瘤治療效果[5]。在臨床實踐中，PET/CT檢查是將采集的數(shù)據(jù)在采集時間范圍內(nèi)取平均值以生成傳統(tǒng)的靜態(tài)PET圖像，并以SUV為指標進行量化，然而SUV是對示蹤劑劑量及患者體重進行歸一化，并且很大程度上取決于注射示蹤劑至掃描的間隔時間，目前SUV仍存在很大的可變性[6]。

示蹤劑在組織中分布的動態(tài)過程可以反映關(guān)于組織代謝特性非常有用的信息，因此，本實驗引入了動態(tài)PET成像技術(shù)，允許隨著時間的推移掃描有限的軸向視野，并采用穩(wěn)定的Patlak圖形分析法，從而提取重要的示蹤劑動力學參數(shù)，即攝取率Ki，它代表示蹤劑絕對代謝率，避免了時間依賴性，能夠?qū)Σ≡钸M行更準確的分析[7]。

以前的研究主要集中關(guān)注PET/CT靜態(tài)顯像，而采用全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像評估OA放射增敏早期療效的研究目前國內(nèi)外尚未見報道。本實驗對大鼠C6膠質(zhì)瘤行放射治療，使用放射增敏劑OA，采用全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像評估OA對荷C6膠質(zhì)瘤大鼠放療增敏的早期療效，觀察并記錄各組荷瘤鼠的生存時間。結(jié)果顯示，OA聯(lián)合放療可抑制腫瘤生長，延長荷瘤鼠的生存時間，然而，在治療后48 h，OA聯(lián)合放療組腫瘤體積較治療前并沒有縮小，且與放療組相比差異無統(tǒng)計學意義，這可能是由于治療后的腫瘤體積受到死細胞清除率、局部結(jié)構(gòu)破壞及周圍組織水腫等多種因素的影響[8]，因此腫瘤體積并不是評價OA放射增敏早期療效的敏感指標。動態(tài)PET/CT Patlak顯像結(jié)果顯示，放療組和OA聯(lián)合放療組的SUVmax及Ki值較放療前均下降，說明放療后，腫瘤細胞活性受到抑制，因此腫瘤病灶的放射性攝取下降，而兩組的SUVmax組間差異無統(tǒng)計學意義，但是兩組的Ki值組間統(tǒng)計學差異顯著，說明全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像在檢測OA治療后腫瘤活性早期變化方面比傳統(tǒng)PET/CT靜態(tài)顯像更敏感。

Ki-67是目前廣泛應(yīng)用的一種細胞增殖標志物，表達于細胞周期的S、G1、G2、M期，G0期不表達，Ki-67表達與細胞增殖活性密切相關(guān)，可以反映腫瘤細胞增殖及預后情況[9-10]。Glut-1是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族中的一種，是細胞攝取葡萄糖的主要載體，可促進葡萄糖轉(zhuǎn)運，腫瘤細胞由于無氧酵解水平的增加，導致Glut-1在惡性腫瘤細胞中有更高水平的表達[11]。本實驗中，放療組與OA聯(lián)合放療組中Ki-67及Glut-1的表達低于對照組，而OA聯(lián)合放療組的表達更低，提示放射治療后，腫瘤細胞的增殖活性及代謝活性均降低，而使用放射增敏劑的OA聯(lián)合放療組對放射治療更敏感。此外，本研究將全身動態(tài)PET/CT結(jié)果與免疫組化結(jié)果進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)動態(tài)PET/CT Ki值與Ki-67及Glut-1表達呈明顯正相關(guān)，進一步驗證了全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像可以反映OA治療后腫瘤細胞增殖活性及代謝活性的早期變化。

綜上所述，OA對大鼠C6膠質(zhì)瘤有放射增敏作用，全身動態(tài)18F-FDG PET/CT Patlak顯像可以通過反映腫瘤細胞增殖活性及代謝活性的早期變化，評估大鼠C6膠質(zhì)瘤放療增敏的早期療效，比傳統(tǒng)PET/CT靜態(tài)顯像更靈敏。