李夢(mèng)雨，張 森，張 麗，王德光

近年來(lái)，慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者發(fā)生認(rèn)知功能障礙倍受重視，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約48%的CKD患者在進(jìn)入透析前已出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙[1]，且隨著腎衰竭進(jìn)展，CKD患者的認(rèn)知障礙發(fā)生率逐漸增加[2]。當(dāng)出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙時(shí)，CKD患者生活質(zhì)量降低、依從性下降，從而影響其臨床治療效果、增加死亡風(fēng)險(xiǎn)。研究[3-4]表明，CKD患者血中維生素D水平明顯低于健康人群，且隨著疾病進(jìn)展，維生素D缺乏率逐漸增加，維生素D水平降低與CKD患者認(rèn)知功能減退存在關(guān)聯(lián)。由于缺乏有關(guān)維生素D對(duì)CKD動(dòng)物認(rèn)知功能影響的報(bào)道，因此，該實(shí)驗(yàn)擬研究維生素D對(duì)腺嘌呤誘導(dǎo)的CKD小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的影響，以期為臨床工作中改善CKD患者認(rèn)知功能提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 56只SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量(17±1) g，動(dòng)物許可證號(hào)為：SCXK(皖)2017-001，倫理審批號(hào)：LLSC20210354。小鼠采用分籠飼養(yǎng)的方式，統(tǒng)一喂養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心，定期更換墊料，給予充足的飼料和飲用水，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度(22.0±2.0) ℃、濕度50%～60%，環(huán)境自然采光和通風(fēng)，12 h光照+12 h黑暗。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 骨化三醇(貨號(hào)：SC8910，北京索萊寶科技有限公司)；肌酐測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：C011-2-1，南京建成生物工程研究所)；尿素氮測(cè)試盒(貨號(hào)：C013-2-1，南京建成生物工程研究所)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20211104，南京建成生物工程研究所)；蘇木精染液(批號(hào)：716092，珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；伊紅染液(批號(hào)：716101，珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；Masson三色染色液(貨號(hào)：C191201，珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。酶標(biāo)儀(型號(hào)：RT-6000，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)；電熱恒溫箱(型號(hào)：DNP-9052BS-Ⅲ，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；正置熒光顯微鏡(型號(hào)：Axiocam 503 Color，德國(guó)蔡司公司)；水迷宮視頻分析系統(tǒng)(型號(hào)：Morris，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組、模型建立及維生素D干預(yù) 將小鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照(CON，n=8)組、模型(CKD，n=12)組、模型+低劑量干預(yù)(LVD，n=12)組、模型+中劑量干預(yù)(MVD，n=12)組、模型+高劑量干預(yù)(HVD，n=12)組。采用腺嘌呤飼料喂養(yǎng)法誘導(dǎo)CKD動(dòng)物模型。小鼠分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，CON組繼續(xù)給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，余4組小鼠給予0.2%腺嘌呤飼料喂養(yǎng)5周，5周后更換為普通飼料。造模第36天起，3組干預(yù)組小鼠分別以20、100[5]或500 ng/kg劑量腹腔注射骨化三醇，每周3次，CON組及CKD組小鼠腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)給藥6周。

1.2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 在各組小鼠給藥結(jié)束后，采用Morris水迷宮對(duì)其認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)估。將水池分為4個(gè)象限，池壁上懸掛4個(gè)不同形狀的幾何圖案，作為小鼠辨別空間位置的視覺參照物，池內(nèi)注入自來(lái)水，以無(wú)毒無(wú)味染料染白，水溫控制在(22.0±1.0) ℃，水池周圍懸掛藍(lán)色窗簾以分隔研究者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，于第二象限中央放置平臺(tái)，位于水下1.0～1.5 cm。實(shí)驗(yàn)包括：① 定位航行實(shí)驗(yàn)：選定四個(gè)入水位置，將各組小鼠依次分別從此四處面朝池壁輕柔地放入水中，每天入水的四個(gè)位置順序隨機(jī)，記錄小鼠找到平臺(tái)所需要的時(shí)間(即為逃避潛伏期)，并允許其在平臺(tái)上停留10～15 s，若小鼠未能在60 s內(nèi)爬上平臺(tái)，則將該小鼠潛伏期記錄為60 s，并用木棒將其引導(dǎo)至平臺(tái)上，且使之停留10～15 s。所有小鼠每日于固定時(shí)間段訓(xùn)練，每只每次訓(xùn)練時(shí)間間隔半小時(shí)以上，連續(xù)訓(xùn)練4 d。② 空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將平臺(tái)從水池中撤去，依次將各組小鼠從第四象限同一入水位置放入水中，記錄60 s內(nèi)小鼠在原平臺(tái)象限的游泳時(shí)間及路程。

1.2.3血中肌酐、尿素氮水平及SOD活性測(cè)定 小鼠眼眶取血，分離血清，-20 ℃冰箱保存，測(cè)定小鼠血清中肌酐、尿素氮含量及SOD活性。

1.2.4腎組織病理 頸椎脫臼法處死小鼠，鈍性分離雙側(cè)腎臟，肉眼觀察腎臟長(zhǎng)徑、色澤的改變，隨之浸于4%多聚甲醛溶液中固定過(guò)夜，常規(guī)行石蠟包埋、切片、HE和Masson染色，在顯微鏡下進(jìn)行腎組織病理學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠基本情況對(duì)照組小鼠反應(yīng)靈敏、毛發(fā)光澤，模型組小鼠日漸精神不振、易脫毛、墊料潮濕嚴(yán)重。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，無(wú)小鼠死亡。

2.2 各組小鼠血清肌酐、尿素氮含量各組小鼠血清肌酐、尿素氮水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與CON組相比，CKD組小鼠肌酐及尿素氮水平升高(P<0.001)。3組干預(yù)組小鼠血清肌酐值與CKD組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，LVD組小鼠尿素氮水平較CKD組下降(P<0.001)，而MVD及HVD組尿素氮水平與CKD組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 各組小鼠腎臟組織病理肉眼下，對(duì)照組小鼠腎臟形態(tài)飽滿，外觀紅潤(rùn)、有光澤；模型組及干預(yù)組小鼠腎臟體積偏小，色澤蒼白，表面有粗糙的顆粒狀物質(zhì)，見圖1。光鏡下，對(duì)照組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)完整清晰，腎間質(zhì)未見明顯膠原纖維；模型組及干預(yù)組腎小球部分萎縮，可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)、蛋白管型、間質(zhì)纖維化，見圖2、3。

圖1 各組小鼠腎臟肉眼觀A：CON組；B：CKD組；C：LVD組；D：MVD組；E：HVD組

圖2 各組小鼠腎臟HE染色 ×200

圖3 各組小鼠腎臟Masson染色 ×200

2.4 各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4、5所示，在定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠逃避潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，CKD組小鼠逃避潛伏期較CON組延長(zhǎng)(P<0.01)，與CKD組相比，MVD、HVD組小鼠的逃避潛伏期縮短(P<0.05，P<0.05)，而LVD組小鼠逃避潛伏期與CKD組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間(P<0.01)及路程(P<0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CKD組小鼠在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間(P<0.01)及路程(P<0.01)較CON組減少，MVD、HVD組目標(biāo)象限游泳時(shí)間(P<0.05，P<0.05)和路程(P<0.05，P<0.01)較CKD組增加，而LVD組與CKD組之間上述兩項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

圖4 定位航行實(shí)驗(yàn)中各組小鼠逃避潛伏期的比較

圖5 空間探索實(shí)驗(yàn)中各組小鼠在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間及路程的比較

2.5 各組小鼠血清SOD活性各組小鼠血清SOD活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.42，P<0.001)，與CON組相比，CKD組SOD活性降低(P<0.001)，與CKD組相比，LVD及MVD組SOD活性升高(P<0.001)，見圖6。

圖6 各組小鼠血清SOD活性的比較

3 討論

認(rèn)知功能障礙是慢性腎臟病神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥之一，是CKD患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6-7]，腎臟替代治療、營(yíng)養(yǎng)干預(yù)等均和認(rèn)知功能有關(guān)聯(lián)。維生素D作為一種多功能類固醇激素，除參與調(diào)節(jié)鈣磷代謝外，對(duì)大腦功能的調(diào)節(jié)亦產(chǎn)生影響。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，給予維生素D可顯著提高阿爾茲海默病[8]、糖尿病[9]等疾病動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)和記憶能力，但尚缺乏關(guān)于維生素D對(duì)CKD小鼠認(rèn)知功能的影響的研究。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腺嘌呤飼料喂養(yǎng)法誘導(dǎo)CKD動(dòng)物模型，觀察維生素D對(duì)CKD小鼠認(rèn)知功能的影響。

目前，CKD動(dòng)物模型的制備方法包括藥物、外科手術(shù)等，本研究采用0.2%腺嘌呤飼料喂養(yǎng)小鼠誘導(dǎo)CKD動(dòng)物模型，從最終的生化數(shù)據(jù)看，模型組小鼠血清肌酐及尿素氮水平較對(duì)照組上升，且模型組腎臟與對(duì)照組相比在肉眼觀及組織學(xué)上均有所變化，和臨床實(shí)際情況較為吻合，與前人研究相比，本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得尿素氮值較高，且干預(yù)組和模型組之間肌酐、尿素氮差別不大，這可能與飼料配比蛋白質(zhì)含量較高有關(guān)。Morris水迷宮是用于評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶功能的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法之一，它利用動(dòng)物逃避水環(huán)境的特性，通過(guò)視頻分析系統(tǒng)對(duì)動(dòng)物入水后尋找隱匿于水下的平臺(tái)所需要的時(shí)間、搜索策略進(jìn)行觀察和記錄，借此推斷動(dòng)物的認(rèn)知功能。本研究結(jié)果顯示，與CON組相比，CKD組小鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，且在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間及路程減少，提示CKD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，這與Tang et al[10]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明在慢性腎臟病疾病狀態(tài)下存在認(rèn)知功能障礙。而經(jīng)維生素D干預(yù)后，CKD小鼠認(rèn)知功能得到改善，主要表現(xiàn)為MVD及HVD組小鼠逃避潛伏期較CKD組縮短，且在原平臺(tái)象限停留時(shí)間及路程增加，提示維生素D可在一定程度上緩解CKD認(rèn)知障礙。有研究指出[11]，過(guò)高劑量維生素D存在致死作用，但本研究過(guò)程中無(wú)實(shí)驗(yàn)小鼠死亡，但未對(duì)維生素D有無(wú)肝臟、骨骼等器官功能障礙進(jìn)行進(jìn)一步研究，維生素D發(fā)揮不同生物學(xué)效應(yīng)的安全劑量范圍仍需進(jìn)一步探索。

既往研究表明，維生素D具有抗炎、抗氧化特性，它通過(guò)增加核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)表達(dá)、維持正常線粒體功能等途徑降低氧化應(yīng)激[12]。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，隨之可造成機(jī)體組織不同程度的損傷，從而引起多種疾病的發(fā)生。慢性腎臟病疾病進(jìn)展過(guò)程中存在嚴(yán)重的氧化應(yīng)激[13]，在CKD早期階段，即可發(fā)生某些氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物(如：氧化型谷胱甘肽、丙二醛、8-羥基鳥嘌呤脫氧核苷等)水平的改變[14]。SOD是一種能夠清除氧自由基的抗氧化酶，本研究觀察到CKD組小鼠血清SOD活性較CON組下降，而與CKD組相比，LVD及MVD組小鼠SOD活性增高，提示維生素D可能通過(guò)發(fā)揮抗氧化作用改善CKD認(rèn)知功能。

綜上所述，CKD小鼠存在認(rèn)知功能減退，維生素D或可通過(guò)抗氧化特性改善其認(rèn)知，這為臨床上防治CKD認(rèn)知功能障礙提供了理論依據(jù)，需要更多的研究以進(jìn)一步探索慢性腎臟病認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制和防治措施。