胡婷婷，何 帆，劉明政，徐文華，王元銀

三叉神經(jīng)痛(trigeminal neuralgia，TN)是頜面外科臨床常見的一種神經(jīng)病理性疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及心理健康[1-2]?？R西平等藥物治療易出現(xiàn)疲勞、頭昏等副作用[1,3]。注射治療、射頻溫控?zé)崮褪中g(shù)等方法也仍不能達(dá)到理想的治療效果[1,3]。因此進(jìn)一步探索TN發(fā)生的機(jī)制，尋找更精確有效的治療方法，已成為近年來的研究熱點(diǎn)[2,4]。

miR-30b是miR30家族的成員，參與了多種疾病的發(fā)病機(jī)制，與神經(jīng)性疼痛、神經(jīng)退行性疾病等有關(guān)[5-6]。目前關(guān)于TN模型大鼠三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglion,TG)中miR-30b的研究較少。激活轉(zhuǎn)錄因子3(activating transcription factor 3,ATF3)與周圍神經(jīng)損傷特異性相關(guān)，被用作神經(jīng)損傷的特定標(biāo)記物[7-8]。故本研究建立大鼠TN模型，通過機(jī)械痛閾測(cè)定及ATF3輔助驗(yàn)證模型，探索miR-30b是否參與調(diào)控TN的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑、儀器Von Frey 毛刷(美國(guó)North Coast公司)；Tissue RNA Purification Kit Plus(上海奕杉生物科技有限公司組織)；PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect real Time)(日本TaKaRa生物科技有限公司) ；TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(日本TaKaRa生物科技有限公司)；Hairpin-itTM microRNA and U6 snRNA Normalization RT-PCR Quantitation Kit(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；KZ-Ⅲ-F高速低溫組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ATF3 Antibody(江蘇親科生物研究中心有限公司，DF6660)；miR-30b agomir、miR-30b agomir NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及TN模型的構(gòu)建

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用體質(zhì)量(180～200) g的成年雄性 Sprange-Dawley(SD)大鼠，常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)溫度控制在22 ℃～25 ℃，12 h交替照明。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：LLSC20190705)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2.2TN模型的構(gòu)建 選用眶下神經(jīng)縮窄術(shù)(infraorbital nerve-chronic constriction injury，ION-CCI)構(gòu)建TN動(dòng)物模型。首先對(duì)大鼠進(jìn)行1周的手術(shù)前適應(yīng)性訓(xùn)練，剔除對(duì)Von Frey毛刷過于敏感或遲鈍的大鼠，并篩選出經(jīng)適應(yīng)性訓(xùn)練后毛發(fā)和觸須完整的大鼠用于TN模型的構(gòu)建。大鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠全身麻醉后，在左側(cè)眶下顴弓和鼻骨結(jié)合處作一切口，長(zhǎng)約5 mm，切口與鼻翼平行，玻璃分針分離眶下神經(jīng)。ION-CCI組大鼠用兩根5-0絲線結(jié)扎眶下神經(jīng)，結(jié)扎線間距約2 mm。結(jié)扎力度適中，使眶下神經(jīng)受到輕微壓迫但未阻斷其血液循環(huán)為宜。結(jié)扎完成后用3-0絲線縫合皮膚創(chuàng)口，涂抹紅霉素軟膏以預(yù)防創(chuàng)口感染[3,9]。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

1.3.1miR-30b在TN大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中的表達(dá) 將SD大鼠隨機(jī)分成2組，即ION-CCI組及假手術(shù)組(Sham組)，6只/組。ION-CCI組于大鼠左側(cè)行眶下神經(jīng)縮窄術(shù)，Sham組除不結(jié)扎眶下神經(jīng)外，其余手術(shù)步驟均與ION-CCI組相同。采用Von Frey毛刷分別測(cè)試大鼠術(shù)前1 d和術(shù)后10個(gè)時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后2、4、6、8、10、12、14、16、21、28 d)時(shí)術(shù)側(cè)觸須墊區(qū)域的機(jī)械痛閾，記錄閾值并對(duì)大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的機(jī)械痛閾進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過實(shí)時(shí)定量免疫熒光反應(yīng)(qRT-PCR)及免疫印跡(Western blot) 檢測(cè)術(shù)側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)(TG)內(nèi)ATF3和miR-30b表達(dá)變化。

1.3.2miR-30b表達(dá)變化對(duì)TN大鼠的影響 將SD大鼠隨機(jī)分成3組，即ION-CCI組、ION-CCI+miR-30b agomir組及ION-CCI+scramble組，7只/組。ION-CCI造模術(shù)后第12天10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)眶下孔分別將miR-30b agomir、agomir NC(20 μmol，10 μl)1次/d，連續(xù)4 d定位注射到ION-CCI+miR-30b agomir組及ION-CCI+scramble組大鼠TG內(nèi)[10]。每次給藥前及最后一次注射給藥后1 d，使用Von Frey毛刷進(jìn)行機(jī)械痛閾測(cè)定。最后一次注射給藥后1 d處死大鼠，采集術(shù)側(cè)TG，通過qRT-PCR以及Western blot方法對(duì)各組大鼠TG中ATF3和miR-30b表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)及對(duì)比。實(shí)驗(yàn)所用微小RNA(microRNA，miRNA)序列見表1。

表1 miRNA序列(5′-3′)

1.4 機(jī)械痛閾測(cè)定測(cè)試于每日16：00～17：00間進(jìn)行，測(cè)試前將大鼠置于安靜環(huán)境中適應(yīng)1 h，用 Von Frey毛刷從最小刺激強(qiáng)度開始依次遞增刺激大鼠術(shù)側(cè)觸須墊區(qū)域，每根毛刷重復(fù)刺激5次，每次間隔時(shí)間不少于30 s，直到某一毛刷激發(fā)大鼠重復(fù)出現(xiàn)以下任一陽(yáng)性反應(yīng)3次：① 快速縮頭、躲避毛刷的行為；② 快速抓咬毛刷的攻擊行為；③ 連續(xù)搔抓術(shù)側(cè)受刺激部位皮膚的行為。此時(shí)記錄該毛刷所代表的刺激強(qiáng)度即為機(jī)械痛閾，并對(duì)大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的機(jī)械痛閾進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 qRT-PCR采集大鼠術(shù)側(cè)TG，采用Tissue RNA Purification Kit Plus(上海奕杉生物科技有限公司)提取mRNA及miRNA；PrimeScript TM RT Reagent Kit(日本TaKaRa生物科技有限公司)、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa生物科技有限公司)、Hairpin-itTM microRNA and U6 snRNA Normalization RT-PCR Quantitation Kit(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)進(jìn)行 cDNA的合成和PCR的擴(kuò)增；熒光定量PCR儀檢測(cè)TG中ATF3及miR-30b的表達(dá)情況。使用 2-ΔΔCt計(jì)算其相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)所用熒光定量PCR基因引物序列見表2。

表2 熒光定量 PCR 基因引物序列

1.6 Western blot采集大鼠術(shù)側(cè)TG組織，稱重后每1 mg組織加入含1%PMSF的10 μl RIPA裂解液，置于KZ-Ⅲ-F高速低溫組織研磨儀中研磨。4 ℃、12 000 r/min 條件下離心10 min，吸取上清液。加入相應(yīng)體積的 5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min使蛋白充分變性，-20 ℃下保存待用。使用10% SDS-PAGE凝膠配制試劑盒制備凝膠，上樣電泳后轉(zhuǎn)模至PVDF膜上，TBST洗滌液反復(fù)洗滌3次，每次10 min，置于5%脫脂奶粉中，室溫下?lián)u床封閉2 h。置于一抗稀釋液中(ATF3 Antibody 1 ∶1 000，江蘇親科生物研究中心有限公司，DF6660；GAPDH Zsbio，TA-08)，4 ℃下孵育過夜。PVDF 膜充分漂洗后置于已稀釋好的二抗中室溫孵育1.2 h。PVDF膜充分漂洗，置于顯影機(jī)內(nèi)設(shè)置條件曝光成像，使用Image J軟件對(duì)曝光后的蛋白條帶圖灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)ATF3蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Grahpad Prism 8.0軟件進(jìn)行分析，ION-CCI組及Sham組兩組間qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)及Western blot 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。機(jī)械痛閾測(cè)定結(jié)果采用雙因素方差分析。ION-CCI組、ION-CCI+scramble組及ION-CCI+miR-30b agomir組qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)和 Western blot 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠TN模型構(gòu)建成功機(jī)械痛閾測(cè)定結(jié)果顯示ION-CCI組大鼠術(shù)后第2～28天機(jī)械痛閾低于Sham組。術(shù)后第2天ION-CCI組大鼠機(jī)械痛閾即開始降低[Sham 組: (1.33±0.16) g，ION-CCI 組: (0.70±0.24) g]，在術(shù)后第12天時(shí)疼痛閾值達(dá)到最低[Sham 組: (1.53±0.39) g，ION-CCI組: (0.11±0.06) g]，且直至術(shù)后28天ION-CCI組大鼠機(jī)械痛閾仍低于Sham組[Sham 組: (1.53±0.39) g，ION-CCI組: (0.32±0.12) g]，F(xiàn)=3.965，P<0.05，見圖1。qRT-PCR結(jié)果顯示術(shù)后第12天ION-CCI組大鼠TG中ATF3 mRNA表達(dá)較Sham組升高，t=5.780，P<0.05，見圖2A。Western blot結(jié)果顯示術(shù)后第12天ION-CCI組大鼠TG中ATF3 蛋白表達(dá)較Sham組升高，t=11.18，P<0.05，見圖2B。以上結(jié)果表明TN模型構(gòu)建成功。

圖1 ION-CCI組及Sham組大鼠在造模術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)機(jī)械痛閾的變化與 Sham組比較：**P<0.01，***P<0.001

圖2 ATF3在ION-CCI組大鼠術(shù)側(cè)TG中的的表達(dá)與Sham組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.2 TN大鼠的術(shù)側(cè)TG中miR-30b表達(dá)降低qRT-PCR結(jié)果顯示在術(shù)后第12天，與Sham組相比，ION-CCI組大鼠TG中miR-30b的相對(duì)表達(dá)量降低，t=6.505，P<0.05，見圖3。

圖3 miR-30b在ION-CCI組大鼠術(shù)側(cè)TG中的表達(dá)與Sham組比較：**P<0.01

2.3 miR-30b類似物對(duì)TN大鼠TG內(nèi)ATF3的表達(dá)的影響注射miR-30b類似物后，與ION-CCI組及ION-CCI+scramble組相比，ION-CCI+miR-30b agomir組機(jī)械痛閾升高，F(xiàn)=21.20，P<0.05；qRT-PCR結(jié)果顯示ION-CCI+miR-30b agomir組大鼠TG中ATF3 mRNA表達(dá)降低，F(xiàn)=8.562，P<0.05；Western blot結(jié)果顯示ION-CCI+miR-30b agomir組大鼠TG中ATF3 的蛋白表達(dá)降低，F(xiàn)=8.353，P<0.05，見圖4。ION-CCI組與ION-CCI+scramble組大鼠機(jī)械痛閾及TG內(nèi)ATF3的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

miRNAs是一類長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA[11]。超過30%的人類蛋白編碼基因可能受到這些miRNAs的調(diào)控[12]。成熟的單鏈miRNA可通過序列完全互補(bǔ)的方式與靶基因mRNA 3’非翻譯區(qū)相結(jié)合，降解mRNA或抑制mRNA的翻譯[11]。miRNAs在病理狀態(tài)下表達(dá)異常，可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[11]。近年來miRNAs在疼痛中的作用受到越來越多的關(guān)注，逐漸成為鎮(zhèn)痛治療的一個(gè)新方向[6]。CCI慢性坐骨神經(jīng)縮窄性損傷后，大約有111種miRNAs表達(dá)異常[13]。Shao et al[14]研究發(fā)現(xiàn)在脊神經(jīng)損傷模型SNL中，miR-30b可通過抑制Nav1.7的表達(dá)緩解大鼠的神經(jīng)性疼痛。Su et al[15]研究發(fā)現(xiàn)在脊神經(jīng)損傷模型SNL中，miR-30b可通過抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和脊髓中Nav1.3的表達(dá)來減輕神經(jīng)性疼痛。目前miRNAs對(duì)痛覺調(diào)控機(jī)制的研究主要集中在背根神經(jīng)節(jié)、脊髓組織和坐骨神經(jīng)痛等，對(duì)其在TN中的作用研究較少。故本研究重點(diǎn)關(guān)注miR-30b在TN模型大鼠TG內(nèi)的表達(dá)及作用。

采用眶下神經(jīng)縮窄模型建立TN是由Vos et al[16]于1994年首次提出的一種經(jīng)典的造模方法，改編自Bennett和Xie[17]的坐骨神經(jīng)慢性結(jié)扎模型，能再現(xiàn)TN的重要方面，模擬出TN的自發(fā)性疼痛及異常性疼痛(痛覺過敏)，通過對(duì)大鼠術(shù)側(cè)觸須墊區(qū)域進(jìn)行機(jī)械痛閾測(cè)定來判斷造模是否成功[3,9]。ATF3是一種轉(zhuǎn)錄因子，也是損傷的初級(jí)傳入神經(jīng)元的敏感標(biāo)記物，與周圍神經(jīng)損傷特異性相關(guān)。ATF3在許多不同組織中被應(yīng)激信號(hào)誘導(dǎo)。在疾病和損傷的動(dòng)物研究中，包括神經(jīng)結(jié)扎、HIV、糖尿病和神經(jīng)毒素等誘導(dǎo)的神經(jīng)病變，ATF3被用作神經(jīng)損傷的特定標(biāo)記物,可以很好地標(biāo)記那些組織損傷后長(zhǎng)期致敏的神經(jīng)元[8]。故在測(cè)定大鼠機(jī)械痛閾之外，本研究通過檢測(cè)TG中ATF3的表達(dá)變化輔助驗(yàn)證SD大鼠ION-CCI所構(gòu)建的TN動(dòng)物模型。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Sham組相比，ION-CCI組術(shù)后第2～28天機(jī)械痛閾降低，術(shù)后第12天達(dá)到最低值；術(shù)后第12天ION-CCI組TG中ATF3 mRNA及蛋白表達(dá)升高，提示TN模型建立成功。ION-CCI組術(shù)后第12天TG中miR-30b表達(dá)降低，提示miR-30b參與了TN的發(fā)生。為進(jìn)一步了解miR-30b表達(dá)變化對(duì)TN大鼠的影響，在ION-CCI術(shù)后第12天，當(dāng)大鼠TN模型穩(wěn)定構(gòu)建時(shí)，經(jīng)眶下孔分別將miR-30b agomir、agomir NC 1次/d，連續(xù)4 d定位注射到ION-CCI+miR-30b agomir組及ION-CCI+scramble組大鼠TG內(nèi)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-30b類似物干預(yù)后，TN大鼠機(jī)械痛閾升高，TG內(nèi)ATF3表達(dá)降低。提示過表達(dá)miR-30b，不僅可以有效抑制TN引起的ATF3的上調(diào)，還能使大鼠的機(jī)械痛閾升高，緩解ION-CCI誘導(dǎo)的TN，從而確定了miR-30b可能是TN潛在的治療靶點(diǎn)。

目前認(rèn)為TN的實(shí)質(zhì)可能是一種過度興奮，表現(xiàn)為血管受壓后脫髓鞘的三叉神經(jīng)出現(xiàn)異常放電或異位動(dòng)作電位[18]。電壓門控鈉離子通道(Voltage-gated sodium channels，VGSC)在神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏膯?dòng)和產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用[2]。研究[14-15]

圖4 各組大鼠眶下區(qū)定位注射不同時(shí)間點(diǎn)機(jī)械痛閾及術(shù)側(cè)TG中ATF3的表達(dá)變化

證實(shí)，某些miRNA可通過調(diào)節(jié)VGSC表達(dá)和神經(jīng)元興奮性，參與神經(jīng)性疼痛的發(fā)展。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-30b與VGSC亞型Nav1.3高度相關(guān)。由此推測(cè)在正常生理狀態(tài)下，miR-30b能夠抑制SCN3A(Nav1.3編碼基因)由mRNA到Nav1.3蛋白的翻譯。在外周神經(jīng)受到損傷時(shí)，miR-30b表達(dá)下調(diào)從而減少對(duì)Nav1.3 mRNA的抑制，Nav1.3表達(dá)增加，引起神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，從而誘發(fā)TN。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步深入探究miR-30b調(diào)控TN的潛在機(jī)制，為TN的治療研究提供新的方向。