倪子樵, 張錦松，高 翔,朱秋璇, 王 鑫,黃海年，朱 飛

目前增生性瘢痕(hypertrophic scar,HTS)的形成機制尚不清楚，其預(yù)防和治療也相對困難。氧化應(yīng)激是機體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生和抗氧化能力失衡的結(jié)果。研究[1]表明，高水平ROS有促纖維化作用，HTS和瘢痕疙瘩中存在氧化應(yīng)激失衡。NRF2/ARE通路是清除ROS的主要途徑。在氧化應(yīng)激過程中，ROS促進NRF2核轉(zhuǎn)位，激活多種抗氧化酶如[NAD ( P ) H:醌氧化還原酶 1 NQO1]、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等表達[2]。

α-硫辛酸(α-lipoic acid,ALA)最初由Reed et al[3]于1951年從牛肝中分離，因其抗氧化特性，ALA可用于多種疾病的治療，如糖尿病、心血管疾病、癌癥和艾滋病。但尚無文獻報道ALA在HTS中的作用。ALA因其穩(wěn)定性差、溶解度低、刺激性強等缺點，不宜直接制備成皮膚制劑使用。本研究將在兔耳HTS模型中探討局部應(yīng)用ALA是否可抑制HTS進展以及對氧化還原相關(guān)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料ALA、10%NaOH溶液、10%HCl溶液(美國Sigma公司)；2-羥丙基-β-環(huán)糊精(上海阿拉丁生化科技有限公司)；HE 染色液、Masson染色試劑盒、RIPA 裂解液、 BCA 蛋白定量試劑盒、DAB 顯色液、ECL 顯色液；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；NRF2、NQO1、SOD1、CAT、HO-1抗體(英國Abcam公司)；T-SOD、MDA、Hyp、GSH、GSH-px、GSR試劑盒(南京建成生物工程研究所)；石蠟包埋機、切片圖像分析系統(tǒng)(德國LEICA)；全自動化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1瘢痕模型的建立和ALA乳膏的制備

1.2.1.1瘢痕模型的建立 隨機選取18只健康新西蘭大白兔，雌雄不限，體質(zhì)量為2.5～3.0 kg，均由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。造模前，適應(yīng)性單籠喂養(yǎng)3 d，維持室內(nèi)溫度21～25℃。根據(jù)李薈元 等[4]建立兔耳HTS模型的方法，3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈麻醉。75%酒精消毒術(shù)區(qū)，術(shù)中嚴(yán)格遵循無菌操作原則。在兔耳腹側(cè)用直徑10 mm的角膜環(huán)鉆鉆穿全層皮膚，骨膜剝離器去除軟骨膜，保留軟骨，按壓止血，然后用生理鹽水清洗后暴露。每只兔耳兩側(cè)長軸方向各制備6個相同的創(chuàng)面，間隔1.5 cm。術(shù)后7 d去除創(chuàng)面痂皮，再次造創(chuàng)后14 d左右所有創(chuàng)面均完成上皮化。

1.2.1.2ALA乳膏制備 根據(jù)Ikuta et al[5]的實驗方法，將2-羥丙基-β-環(huán)糊精溶解于10%NaOH中，攪拌至完全溶解，按2:1比例加入ALA粉末，充分?jǐn)嚢柚烈后w澄清透明。再用10%HCl滴定至pH=7.0，形成穩(wěn)定的ALA/β-CD包合物。將ALA/β-CD和凡士林、液體石蠟按 2 ∶1 ∶1充分混合，制備成ALA乳膏。

1.2.2實驗分組及給藥 術(shù)后第20 d，所有創(chuàng)面均完全再上皮化并形成早期HTS。隨機將動物分為2組，模型組(HTS組)不予以特殊處理，實驗組(ALA組)涂抹質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%ALA軟膏(預(yù)實驗篩選濃度確定)，根據(jù)Arivazhagan et al[6]提出的ALA有效抑制脂質(zhì)過氧化的濃度[100 mg/(kg·d)]，用量0.1 g/次，2次/d，連續(xù)用藥28 d。另取6只作空白對照。術(shù)后第49 d處死所有實驗動物，每組獲得標(biāo)本72個，每個瘢痕在最大突起處被一分為二，一部分立即用10%福爾馬林固定脫水，石蠟包埋切片行后期染色觀察。一部分放置于-80 ℃冰凍保存，測定氧化應(yīng)激等相關(guān)蛋白表達的指標(biāo)。

1.2.3大體觀察 所有創(chuàng)面再上皮化后，動態(tài)觀察并記錄各組增生性瘢痕的大體情況，在給藥后第7、14、28 d，每組隨機選擇18個瘢痕組織，由3名技術(shù)人員在相同條件下分別通過色澤、血管分布、厚度、柔軟度評估各組瘢痕增生程度，根據(jù)溫哥華瘢痕評定量表(VSS)，最高分為13分，最低分為0分。對每一個瘢痕評分取平均值，并做統(tǒng)計學(xué)處理。連續(xù)用藥28 d后，在無菌條件下取材。

1.2.4病理指標(biāo)檢測 將取出的組織用10%中性福爾馬林固定24 h，石蠟包埋后制備3～4 μm切片。使用蘇木精-伊紅(HE)染色進行光鏡檢查，光鏡下觀察HTS形態(tài)及成纖維細(xì)胞計數(shù)；按照Masson染色試劑盒說明書行Masson染色，脫水后用二甲苯透明、封片，顯微鏡下拍照分析。

1.2.5免疫組化檢測HTS中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、CD34、Ki67表達 石蠟包埋的組織切片(4 μm)脫蠟、脫水和復(fù)水。加入3% H2O2阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性，漂洗后，一抗(collagen 1:1 ∶300; collagen 3:1 ∶300；CD 34:1 ∶400；Ki67:1 ∶200 )孵育60 min，沖洗后加二抗孵育20 min，蘇木精復(fù)染。顯微鏡下捕獲圖像。

1.2.6生化指標(biāo)檢測MDA、Hyp、GSH-px、GR、GSH、T-SOD水平 取保存在-80 ℃的各組組織，與冷卻的Tris-HCL緩沖液以1 ∶5(W/V)比例冰浴勻漿，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上清液行樣本分析。按照MDA、Hyp、GSH試劑盒操作說明檢測各組組織中MDA、Hyp、GSH含量。按照GSH-px、GR、T-SOD試劑盒操作說明檢測各組樣本中GSH-px、GR、T-SOD活性。

1.2.7Western blot檢測組織中NRF2、SOD-1、NQO1、CAT、HO-1蛋白相對含量 取各組樣本，提取總蛋白和核蛋白。SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝膠電泳)用于將等量的蛋白質(zhì)(10～20 μg)轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上。 將PVDF膜與抗體HO-1(1 ∶1 000)、NRF2 (1 ∶1 000)、SOD1 (1 ∶1 000)、NQO1 (1 ∶1 000)、CAT(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶2 000)、LaminB1(1 ∶1 000)共同孵育 2 h。一抗孵育后，再將PVDF膜與山羊抗兔IgG抗體或山羊抗小鼠IgG抗體孵育1～2 h，然后將膜在 DPS-Tween 20 中洗滌4次，8 min/次，洗滌過后用 ECL 試劑盒進行信號檢測。

2 結(jié)果

2.1 ALA對HTS抑制效果的大體觀察兔耳增生性瘢痕模型創(chuàng)面于術(shù)后20 d左右完成上皮化，所有創(chuàng)面均愈合良好。上皮化后局部涂抹藥物，肉眼觀察并拍照評估各組兔耳HTS組織的大小、顏色變化。局部給藥第7、14、28 d，每組隨機選取18個瘢痕，每個瘢痕評分取平均數(shù)行統(tǒng)計學(xué)處理(圖1)，第7 d時，4% ALA組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，第14天與28天時4% ALA組與模型組比較，溫哥華瘢痕評分降低(F14 d=1.262，P<0.001；F28 d=2.102，P<0.001)。實驗組較模型組瘢痕體積減小，瘢痕顏色變淺，硬度降低。模型組呈現(xiàn)HTS的典型表現(xiàn)。見圖2。

圖1 模型組與4%ALA組瘢痕在不同時間溫哥華瘢痕評分

2.2 ALA對HTS組織結(jié)構(gòu)的影響HE染色顯示模型組真皮層明顯增厚，乳頭層和網(wǎng)狀層邊界模糊。高倍視野下真皮內(nèi)成纖維細(xì)胞、微血管也明顯增多，表現(xiàn)為輕度的慢性炎癥。4% ALA治療28 d的瘢痕，瘢痕真皮層明顯變薄，細(xì)胞和微血管明顯減少。Masson染色顯示模型組組織切片中真皮深層膠原纖維致密，膠原纖維較寬，排列紊亂，呈結(jié)節(jié)狀、圓形或螺旋狀排列。相反，4%ALA組中膠原纖維細(xì)長，顏色淺藍(lán)色，密度降低，平行于皮膚表面，有向正常皮膚組轉(zhuǎn)化的趨勢。見圖2。

圖2 肉眼觀察ALA對兔耳增生性瘢痕模型的影響

2.3 ALA對HTS中CD34、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和Ki67表達影響正常組、模型組和4%ALA組中CD34陽性細(xì)胞的表達，主要定位在微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中，呈棕黃色或褐色。模型組中CD34陽性表達的微血管數(shù)高于正常組及ALA組；Col Ⅰ和Col Ⅲ主要表達于細(xì)胞外基質(zhì)中，模型組中Col Ⅰ和Col Ⅲ陽性面積多于正常組及4%ALA組；模型組中，Ki67陽性表達率多于正常組及4%ALA組。見圖3。

圖3 ALA對兔耳增生性瘢痕模型組織形態(tài)的影響 HE&Masson染色 ×200

2.4 ALA對HTS中MDA、Hyp、GSH含量及GSH-px、GR、T-SOD活性的影響與4%ALA組及正常組相比，模型組中MDA、Hyp含量明顯升高， GSH-px、GR活性均明顯升高，GSH水平明顯降低，T-SOD活性逐漸遞增(FGR=79.36,FGSH=237.3,FGPX=164,FHYP=285.5,FMDA=320.2,FT-SOD=99.25)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

圖4 ALA對兔耳增生性瘢痕模型組織CD34、Col Ⅰ、Col Ⅲ表達的影響 免疫組化 ×400

2.5 ALA對HTS中NRF2、SOD1、NQO1、CAT、HO-1蛋白表達的影響在正常組、模型組、4%ALA組中，NRF2、SOD1、NQO1、CAT、HO-1蛋白表達逐漸遞增(F總NRF2=57.82，F(xiàn)HO-1=216.5，F(xiàn)NQO1=198.4,FCat=103.7，F(xiàn)SOD1=480,F核NRF2=90.04)，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 ALA對兔耳增生性瘢痕模型中生化指標(biāo)的影響

3 討論

HTS形成的機制目前尚不完全清楚，以成纖維細(xì)胞持續(xù)活化和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為特征。局部應(yīng)用抗瘢痕藥物的優(yōu)點在于無創(chuàng)且易于使用，可提高患者的依從性[7]。因此，臨床上致力于尋找一種早期干預(yù)、安全性高、創(chuàng)傷小的治療方法。氧化應(yīng)激的相關(guān)機制已相對明確，近期已有研究[8]表明，氧化還原失衡可能在增生性瘢痕的進展過程中起重要作用。

圖6 ALA對兔耳增生性瘢痕模型中NRF2通路相關(guān)蛋白表達的影響

ALA作為一種強效的抗氧化劑，能夠提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化水平，清除和滅活自由基，保護細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。Podda et al[9]通過局部應(yīng)用14C標(biāo)記的ALA探究其在裸鼠皮下動力學(xué)的分布，證實ALA可通過皮膚吸收。Beitner et al[10]使用5%含ALA的面霜進行了關(guān)于光老化的雙盲隨機對照研究，證明其局部應(yīng)用的安全性和有效性。

本實驗成功建立兔耳增生性瘢痕模型，局部外涂ALA治療后，通過大體觀察、病理切片HE染色等指標(biāo)證實ALA對HTS具有抑制作用。ALA提高HTS組織內(nèi)抗氧化酶的含量，激活NRF2/ARE通路，提示ALA發(fā)揮抗瘢痕作用可能與提高HTS組織內(nèi)抗氧化能力有關(guān)。

細(xì)胞內(nèi)的ROS主要由線粒體產(chǎn)生[11]。MDA含量高低間接反應(yīng)機體細(xì)胞受ROS攻擊的嚴(yán)重程度。但本研究結(jié)果顯示，模型組中MDA和T-SOD水平較均較正常組升高，考慮是HTS的抗氧化能力不足以清除大量升高的ROS，長期暴露在高水平ROS條件下的瘢痕組織，抗氧化物耗竭，氧化與抗氧化之間的平衡傾向于氧化，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷。促進成纖維細(xì)胞活化和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，ALA處理后的HTS抗氧化能力增強，證實了ALA的調(diào)節(jié)作用。

谷胱甘肽(GSH)循環(huán)是機體內(nèi)重要的抗氧化保護機制之一[12]，已有研究[13]表明ALA可通過NRF2/ARE信號通路通過GR再生GSH來減輕鎘誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激。本研究模型組中GSH-px、GR活力及GSH水平較正常組降低，因此GSH可能直接參與HTS內(nèi)清除ROS的作用，在HTS中，由于ROS增加導(dǎo)致GSH含量降低，而在ALA治療后，GSH-px、GR活力增加，同時GSH水平相應(yīng)增加，這與本課題組預(yù)期結(jié)果相同。提示ALA可能通過NRF2/ARE信號通路增加HTS內(nèi)GSH的循環(huán)，增強瘢痕組織抗氧化能力。

NRF2/ARE信號通路是體內(nèi)清除ROS的主要途徑，作為氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，激活的NRF2可以從細(xì)胞質(zhì)移位到細(xì)胞核，并抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，調(diào)控一系列抗氧化酶表達。其蛋白表達水平間接反應(yīng)機體清除氧自由基的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，HTS中NRF2表達及核轉(zhuǎn)位增加，其下游相應(yīng)的抗氧化蛋白表達相應(yīng)增加，但HTS中仍處于高水平氧化應(yīng)激狀態(tài)。在ALA處理后的HTS中，NRF2蛋白表達及核轉(zhuǎn)位和其下游的抗氧化蛋白較模型組中表達增加，氧化應(yīng)激水平相應(yīng)降低。ALA加速增生性瘢痕中NRF2的核轉(zhuǎn)位，增加了抗氧化蛋白的表達，增強了HTS組織中的抗氧化能力，減輕了瘢痕組織中的氧化損傷。

已有研究[14]表明高濃度ALA可導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。前期預(yù)實驗采用1%、2%、4%和8%ALA處理HTS，結(jié)果提示4%ALA對HTS抑制效果最佳，因此本實驗將4%ALA設(shè)為最適濃度。后續(xù)將通過設(shè)置更小濃度梯度探究ALA在HTS中的最佳作用濃度。本研究僅在組織學(xué)及蛋白水平證實ALA增強了HTS的抗氧化能力，抑制瘢痕增生，未對NRF2/ARE通路及相關(guān)抗氧化蛋白的基因表達進行深入探究，但仍為后續(xù)研究提供了科學(xué)依據(jù)。