倪良厚，楊 沫，李曼曼，王運(yùn)來，宣自華，許 釩

鈉水潴留是腎病綜合征(nephrotic syndrome, NS)水腫發(fā)生的主要因素[1]。目前在NS中，對于水鈉潴留的研究主要基于血液及尿液， 表現(xiàn)為尿液Na+排泄降低，血液Na+基本不變，體內(nèi)潴留Na+分布不明[2-3]。進(jìn)一步研究[4]表明，在皮膚中有大量的Na+儲存，表明皮膚可以作為Na+的儲存庫。糖胺聚糖(Glycosaminoglycan , GAGs)在皮膚組織間質(zhì)中大量存在，在生理pH值下，每個(gè)GAGs二糖單位具有1～3個(gè)陰離子位點(diǎn)，可與Na+等陽離子通過靜電作用相互結(jié)合[5]。毛細(xì)淋巴管在腎臟中的重要生理功能是單向輸送大分子物質(zhì)、電解質(zhì)等至靜脈。LYVE-1是淋巴內(nèi)皮細(xì)胞上的主要透明質(zhì)酸受體，是區(qū)分血液和淋巴網(wǎng)絡(luò)的標(biāo)志物[6]。相關(guān)研究[7-8]表明，高滲環(huán)境可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TonEBP，促使巨噬細(xì)胞分泌VEGFC，與毛細(xì)淋巴管上的VEGFR3結(jié)合，從而誘導(dǎo)毛細(xì)淋巴管網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)張，以清除組織間質(zhì)高滲物質(zhì)。因此，推測NS潴留的Na+可能通過毛細(xì)淋巴管與靜脈的交互作用，運(yùn)輸至皮膚，與皮膚中GAGs結(jié)合，達(dá)到存儲目的。綜上，本實(shí)驗(yàn)旨在對NS大鼠體內(nèi)Na+分布及其機(jī)制進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物雄性SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠16只，體質(zhì)量(200±20)g，購于邳州市東方養(yǎng)殖公司，許可證號SCXK(蘇)2017-0003，合格證編號：202107564。實(shí)驗(yàn)方案由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審核通過。動物倫理編號：AHUCM-rats-2021068。實(shí)驗(yàn)動物在溫度(23±1)℃、相對濕度50%～60%的環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，12 h光照黑暗交替，所有大鼠進(jìn)行兩次尿蛋白定性實(shí)驗(yàn)(尿蛋白試紙法)均為陰性。

1.2 主要試劑注射用鹽酸多柔比星(阿霉素，Adriamycin，ADR)(批號：21014711)，杭州瀚暉制藥有限公司；BCA蛋白定量試劑盒(批號：0508A21)，肌酐(Creatinine，Cr)檢測試劑盒(批號：0508A21)，北京雷根生物技術(shù)有限公司；Na試劑盒(批號：20210420)，南京建成生物工程研究所；總蛋白(total protein，TP)測定試劑盒(批號：AUZ8665)，白蛋白(albumin，ALB)測定試劑盒(批號：AUZ8692)，膽固醇(total cholesterol，TC)測定試劑盒(批號：AUZ8183)，三酰甘油 (triGlyceride，TG)測定試劑盒(批號：AUZ8611)，尿素氮(urea nitrogen，BuN)測定試劑盒(批號：AUZ8995)，肌酐測定試劑盒(批號：AUZ2490)，美國貝克曼庫爾特公司；大鼠糖胺聚糖ELISA試劑盒(批號：10/2021)，上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司；兔抗GAPDH抗體(批號：GR3316865-1)，英國Abcam公司；兔抗TonEBP抗體(批號：KK1108)，成都正能生物科技有限公司；兔抗LYVE-1抗體(批號：1901R01-2)，兔抗VEGFC抗體(批號： 2020091002)，美國Novus公司；兔抗VEGFR3(批號：VJ3101245)，美國Thermo Fisher公司；山羊抗兔IgG(HRP)(批號：GR335516-1)，英國Abcam公司；ECL發(fā)光液(批號：P10100)，蘇州新賽美生物科技有限公司；甲醛(批號：10010018)，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(批號：A0428)，DAPI染色液(批號：C1002)，防淬滅封片劑(批號：P0126)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器SOLAAR AA原子吸收光譜儀，美國Thermo Corporation公司；BeckmanAU-5800全自動生化分析儀，美國貝克曼庫爾特公司；MultiskanMK2酶標(biāo)儀，美國Thermo Lab systems公司；BHWY-100BC型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，常州杰博儀器有限公司；Eppendorf Centrifuge 5810R型離心機(jī)，德國Eppendorf公司；FA2004型電子天平，上海精科儀器有限公司；ECLIPSE Ni熒光顯微鏡，日本NIKON公司；DHG-9023A恒溫烘箱，上海恒一科學(xué)儀器有限公司；CM1850冷凍切片機(jī)，PPTHK-21B，攤片機(jī)，德國Leica公司；AMERSHAM IMAGER 600超靈敏多功能成像儀，美國通用電氣公司。

1.4 模型建立及分組雄性SD大鼠16只，分為正常組和模型組，每組8只，模型組通過兩次(第1周4 mg/kg，第2周2 mg/kg)尾靜脈注射ADR建立NS大鼠模型，正常組給予等量0.9%氯化鈉溶液。BCA蛋白測定試劑盒檢測12 h尿蛋白含量。自大鼠造模起每周稱量體重1次。

1.5 尿生化指標(biāo)檢測自大鼠造模第0天起，每天將大鼠置于代謝籠12 h，收集大鼠12 h尿液，連續(xù)收集造模第0～14天及第21天大鼠尿液。收集的尿液，在離心機(jī)上進(jìn)行離心，調(diào)整轉(zhuǎn)速為3 500 r/min，時(shí)間為10 min，溫度為4 ℃，移液槍取3 ml上清液置于5 ml EP管中。利用試劑盒檢測大鼠尿蛋白、肌酐以及尿Na+水平。

1.6 血漿Na+水平及血清生化指標(biāo)檢測第0、7、14天，采用眼眶取血，收集大鼠血液0.5 ml，室溫放置30 min，3 500 r/min，離心10 min，分離血漿。第21天收集12 h尿液后，腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠，大鼠麻醉后，剃除大鼠全身毛發(fā)，以10 ml注射器從腹主動脈進(jìn)行取血，分別加入非抗凝管5 ml、肝素抗凝管5 ml，室溫放置30 min，3 500 r/min，離心10 min，分離血清及血漿。利用試劑盒及全自動生化分析儀檢測血漿Na+及血清總蛋白、白蛋白、總膽固醇、三酰甘油 、尿素氮、肌酐。

1.7 大鼠皮膚GAGs含量檢測腹主動脈取血處死大鼠后，自大鼠耳根部開始，剝離大鼠完整皮膚，剔除皮膚上多余的肌肉、脂肪以及結(jié)締組織。精密稱取100 mg背部皮膚組織，加入2 ml PBS，pH 7.4，充分研磨。2 500 r/min離心20 min，收集上清液，按照酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒操作步驟檢測皮膚GAGs含量。剩余的皮膚組織用作大鼠皮膚含水量及鈉含量檢測。

1.8 大鼠皮膚含水量及鈉含量檢測將剝離的大鼠皮膚置于90 ℃烘箱中干燥72 h至恒重，稱重，計(jì)算皮膚含水量；2次質(zhì)量差值不大于 3 mg，即認(rèn)為質(zhì)量恒定。皮膚含水量=濕重-干重[9]，皮膚含水量百分比=(濕重-干重)/濕重。將干燥后的皮膚再次在190 ℃、450 ℃下各干燥24 h，將分離的組織搗碎，在600 ℃下干燥48 h，之后溶解于10 %硝酸中，采用原子吸收光譜法檢測Na+濃度[9]。

1.9 腎皮質(zhì)TonEBP、VEGFC、VEGFR3、LYVE-1蛋白的表達(dá)檢測采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測腎皮質(zhì)蛋白表達(dá)。精密稱取100 mg腎皮質(zhì)，研磨并裂解。根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒檢測組織總蛋白濃度；制備分離膠、濃縮膠后上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜。封閉后分別按比例加入相應(yīng)的一抗TonEBP(1 ∶1 000)、VEGFC(1 ∶1 000)、VEGFR3(1 ∶1 000)、LYVE-1(1 ∶1 000)、內(nèi)參GAPDH(1 ∶10 000)孵育，4 ℃過夜，加入IgG-HRP(1 ∶10 000)室溫孵育1.5 h，加ECL發(fā)光液顯影，使用ImageJ軟件分析相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.10 腎皮質(zhì)淋巴管密度檢測利用免疫熒光法檢測腎皮質(zhì)淋巴管密度。切片前將組織樣本于-80 ℃冰箱取出，置于-20 ℃冰箱內(nèi)復(fù)溫30 min，使用OTC包埋組織，-20 ℃靜置15 min，使組織固定在樣品托上，切片，厚度為5～7 μm，將切片置于4%多聚甲醛溶液中固定；將固定好的組織加入含有LYVE-1(1 ∶100)的孵育盒中，4 ℃孵育過夜，0.02 mol/L PBS沖洗3 min×3次。加入熒光二抗(1 ∶200)，濕盒孵育，室溫下放置1 h。0.02 mol/L PBS沖洗3 min×3次。防淬滅封片劑與DAPI(1 ∶400)稀釋封片，-20 ℃冰箱保存，熒光顯微鏡拍片。根據(jù)Weidner經(jīng)典計(jì)數(shù)方法[10]，即先在低倍鏡(×100)下觀察LYVE-1陽性染色的淋巴管，選擇染色最多的區(qū)域，然后在高倍鏡(×200)下進(jìn)行觀察，任何被LYVE-1抗體染成綠色的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞或淋巴內(nèi)皮細(xì)胞簇，均作為一個(gè)淋巴管計(jì)數(shù)，15個(gè)視野取平均值即為此張切片淋巴管密度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 23.0進(jìn)行分析，結(jié)果以表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量、造模后尿蛋白含量以及尿蛋白/肌酐與正常組相比，造模后模型組大鼠體質(zhì)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=6.77，t2=9.61，t3=11.72，P<0.01)；大鼠12 h尿蛋白含量第14天升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.22，P<0.01)，提示造模成功，第21天檢測尿蛋白含量，未發(fā)現(xiàn)模型恢復(fù)現(xiàn)象；尿蛋白/肌酐于第10天升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.18，P<0.01)，并持續(xù)升高。見圖1。

圖1 ADR模型組和正常組大鼠的體質(zhì)量、尿蛋白含量和尿蛋白含量/肌酐

2.2 血清生化指標(biāo)與正常組相比，模型組大鼠血清TC、TG、BuN、Scr升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tTC=5.01，tTG=4.97，tBuN=4.81，tScr=3.87，P<0.01)，TP和ALB下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tALB=9.08，tTP=11.34，P<0.01)。見表1。

2.3 尿鈉排泄量及血漿鈉濃度與正常組相比，模型組大鼠尿Na+排泄從首次造模后第2天開始下降(t2=7.44，P<0.01)，并于第5～11天降至最低(t5=6.34，t6=4.63，t7=7.21，t8=3.81，t9=8.15，t10=7.18，t11=5.54，P<0.01)，第21天模型組尿Na+排泄，但仍低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t21=2.25，P<0.05)。與尿Na+排泄趨勢不同的是第21天模型組大鼠血漿Na+水平較正常組略有上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.46)。見圖2。

圖2 ADR模型組和正常組大鼠的尿鈉排泄量和血漿鈉濃度A:各組大鼠尿鈉排泄情況；B:各組大鼠血漿Na+濃度；與正常對照組比較；*P<0.05，**P<0.01

2.4 大鼠皮膚濕重、干重及含水量百分比與正常組相比，模型組的濕重和干重低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t濕=9.33，t干=7.59，P<0.01)；干燥法檢測兩組大鼠皮膚含水量百分百比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.84)。見圖3。

表1 ADR模型組和正常組大鼠血清生化指標(biāo)

圖3 ADR模型組和正常組大鼠皮膚的濕重、干重、含水量百分比A:各組大鼠皮膚濕重；B：各組大鼠皮膚干重；C:各組大鼠皮膚含水量百分比；與正常對照組比較：**P<0.01

2.5 模型組大鼠尿液Na+與血漿Na+水平與第0天相比，模型組大鼠尿Na+排泄持續(xù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t7=7.21，P<0.01；t14=2.95，t21=2.25，P<0.05)；而血漿Na+水平基本不變(t7=0.03，t14=0.07，t21=0.46)。見圖4。

圖4 ADR模型組大鼠尿鈉排泄與血漿Na+水平分析與第0天比較：*P<0.05，** P<0.01

2.6 大鼠皮膚鈉含量、皮膚鈉含量/濕重和皮膚鈉含量/干重與正常組相比，模型組大鼠皮膚鈉含量、皮膚鈉含量/濕重和皮膚鈉含量/干重升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t含量=8.89，t含量/濕重=6.32，t含量/干重=9.70，P<0.01)。見圖5。

圖5 ADR模型組和正常組大鼠皮膚鈉含量、皮膚鈉含量/濕重和皮膚鈉含量/干重A:各組大鼠皮膚鈉含量；B:各組大鼠皮膚鈉含量/濕重；C:各組大鼠皮膚鈉含量/干重；與正常對照組比較：**P<0.01

2.7 皮膚GAGs含量與正常組相比，模型組大鼠皮膚GAGs含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.314，P<0.01)。見圖6。

圖6 ADR模型組和正常組大鼠皮膚GAG含量與正常對照組比較：**P<0.01

2.8 腎皮質(zhì)中TonEBP、VEGFC、VEGFR3、LYVE-1蛋白的表達(dá)情況與正常組相比，模型組大鼠腎皮質(zhì)中TonEBP、VEGFC、VEGFR3、LYVE-1蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tTonEBP=4.12，tVEGFC=7.25，tVEGFR3=8.38，tLYVE-1=7.05，P<0.05或0.01)。見圖7。

圖7 ADR模型組和正常組大鼠腎皮質(zhì)中TonEBP、VEGFC、VEGFR3、LYVE-1蛋白的表達(dá)情況

2.9 腎皮質(zhì)淋巴管密度變化情況與正常組相比，模型組LYVE-1淋巴管密度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.61，P<0.01)。見圖8。

圖8 ADR模型組和正常組大鼠腎皮質(zhì)淋巴管密度檢測 ×200與正常對照組比較：**P<0.01

3 討論

水腫作為NS臨床主要表現(xiàn)之一，鈉水潴留是其發(fā)生的主要因素[1]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NS模型大鼠尿蛋白升高，血清生化指標(biāo)顯示NS大鼠腎功能下降，尿鈉排泄下降，血漿Na+含量無明顯變化，提示從首次造模后的第2天開始，機(jī)體處于鈉蓄積狀態(tài)，并且這一狀態(tài)在其成模之后依然保持。

Na+是人體中一種主要的電解質(zhì)，在維持生理穩(wěn)態(tài)(包括神經(jīng)活動、肌肉功能和代謝調(diào)節(jié))方面有著重要的作用。由于Na+及配對陰離子是細(xì)胞外主要的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠?qū)?xì)胞內(nèi)外的水分進(jìn)行調(diào)節(jié)，所以Na+的最重要的功能之一是體液容量調(diào)節(jié)[11]。在一項(xiàng)長期研究[12]中，觀察到的Na+的規(guī)律性釋放和儲存導(dǎo)致身體Na+含量的變化，大量Na+被儲存在體內(nèi)而沒有相應(yīng)的液體保留，說明體內(nèi)有一個(gè)位置可以儲存和釋放Na+。另有研究[13]表明，高血壓大鼠皮膚鈉含量增加，一定程度上提示了皮膚作為鈉存儲的可能位置。

低鹽飲食導(dǎo)致大鼠皮膚GAGs含量下降，組織間質(zhì)的電荷密度及Na+結(jié)合位點(diǎn)下降，而高鹽飲食可以刺激皮膚GAGs含量增加，以此增加與Na+結(jié)合的能力[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組與對照組之間皮膚鈉含量升高，皮膚含水量百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GAGs含量升高，提示Na+在皮膚中可能是與GAGs相結(jié)合，達(dá)到鈉存儲的目的，并且皮膚中增加的鈉是以一種不引起滲透壓改變的形式存在，不引起皮膚組織的含水量等相關(guān)變化。

相關(guān)研究[15]表明在鼠尾淋巴水腫模型中，VEGFC表達(dá)升高，VEGFC的過度表達(dá)導(dǎo)致淋巴水腫加重，增加可溶性VEGFR3可以阻斷VEGFC表達(dá)，以此減輕水腫的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠腎皮質(zhì)TonEBP、VEGFC、VEGFR3、LYVE-1蛋白表達(dá)升高，同時(shí)免疫熒光結(jié)果表明，模型組大鼠淋巴管密度升高。因此，推測NS過度重吸收Na+造成腎臟組織間質(zhì)高滲微環(huán)境，激活TonEBP /VEGFC/ VEGFR3調(diào)節(jié)機(jī)制，將腎臟組織間質(zhì)過多的Na+通過淋巴管回流至血液循環(huán)，通過血液循環(huán)，進(jìn)而存儲于皮膚組織間質(zhì)GAGs網(wǎng)絡(luò)中。此外，鹽敏感性高血壓小鼠給予VEGFC激動劑后，其腎臟和皮膚淋巴擴(kuò)張，可以減輕鹽敏感性高血壓導(dǎo)致的腎臟損傷[8]，即皮膚中的Na+儲存可能是生物體在高鹽飲食或面對高鹽環(huán)境脅迫時(shí)的一種保護(hù)機(jī)制。

本研究結(jié)果指出NS大鼠Na+主要分布在血液、尿液和皮膚，初步證實(shí)了皮膚可能是Na+存儲的位置。后期將對Na+在NS中如何進(jìn)入并存儲于皮膚中，皮膚中存儲的Na+是否進(jìn)入循環(huán)開展進(jìn)一步的研究。