劉珂珂, 胡韶光，呂代雨，查賢芳，孫曉瑜，徐 燕

牙周炎是一種由菌斑微生物引起的慢性感染性疾病，其臨床病理表現(xiàn)為牙齦炎癥、牙周袋形成、牙槽骨吸收、牙齒松動移位[1]，研究[2]表明Toll樣受體4(toll like receptors-4，TLR4) /NF-κB信號通路在其病情發(fā)展中起重要作用。近年來,越來越多的研究表明牙周炎與阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)具有相關性[3-4]。

AD是最常見于老年人的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理特征為腦組織中的β淀粉樣蛋白(amyloid-beta protein，Aβ)異常聚集形成淀粉樣斑塊、過度磷酸化的tau蛋白形成神經纖維纏結伴隨著神經元變性等[5]。研究[6]表明慢性炎癥參與Aβ的產生和積累，導致tau蛋白過度磷酸化、神經原纖維纏結病變、神經元變性死亡。該研究通過探討實驗性牙周炎大鼠腦內炎癥因子及Aβ水平的變化，以期為進一步探索兩者之間關系奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

1.1.1實驗動物 普通清潔級健康SD雄性大鼠18只，體質量(350～400)g，18月齡，購自安徽醫(yī)科大學動物實驗中心并提供標準飼養(yǎng)，檢查大鼠雙側上下頜第一磨牙牙周組織均正常，經由安徽醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準(編號：20180159)。

1.1.2主要試劑與儀器 牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis，Pg) (標準菌株ATCC33277，廣東省微生物菌種保藏中心)；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(江門凱林貿易有限公司)；厭氧培養(yǎng)箱(DonWhitleyDG250 Anaerobicworkstation，英國)；維生素K1(上海麥克林生化科技有限公司)；氯化血紅素(青島海博生物技術有限公司)；TAK-242(美國MedChemExpress公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)(美國Sigma公司)；TRIzol? Reagent (美國Invitrogen公司)；PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉錄試劑盒，TB Green? Premix Ex TaqTMqPCR試劑盒(日本Takara Bio公司)；引物：GAPDH、白介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)均購自上海生工生物工程股份有限公司；實時熒光定量PCR儀(美國安捷倫，Mx3000P)等。

1.2 實驗方法

1.2.1Pg的培養(yǎng)與鑒定 將Pg(ATCC33277)凍干粉用0.2 ml PBS充分溶解混勻，劃線法接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱中(37 ℃，混合氣比例：80% N2、10% CO2、10% H2)培養(yǎng)5～7 d，待培養(yǎng)基表面長出黑色菌落，挑取單個直徑約1 mm的菌落接種于5 ml BHI液體培養(yǎng)基(加入維生素K1及氯化血紅素)進行擴增培養(yǎng)。

1.2.2大鼠實驗性牙周炎模型的建立 18只SD大鼠隨機分為3組(n=6)，分組情況如下：① 空白對照(control)組：不做任何處理；② 慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)組：結扎雙側上頜第一磨牙輔以接種牙齦卟啉單胞菌；③ 慢性牙周炎+TAK-242(CP+TAK-242)組：結扎雙側上頜第一磨牙輔以接種牙齦卟啉單胞菌，腹腔注射TAK-242。

大鼠用2%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)腹腔注射麻醉后固定于操作板上，用4-0外科絲線結扎雙側上頜第一磨牙牙頸部，定期檢查結扎絲線在位情況，松脫者及時重新結扎。結扎1周后將Pg以1×108CFU/ml的濃度接種到結扎部位，每只大鼠每次接種150 μl,每3 d接種1次，共接種5次，整個建模時間共6周。TAK-242溶于1% DMSO生理鹽水溶液, 使其終濃度為0.5 mg/ml，腹腔注射TAK-242 (0.5 mg/kg)，每周2次，持續(xù)到實驗結束。實驗時間軸如圖1所示。

圖1 時間軸線圖

1.2.3大鼠海馬組織和牙周組織取材 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后立即進行斷頭取腦，低溫快速分離兩側海馬于1.5 ml Eppendorf管中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。分離牙槽骨和牙齦組織，將牙齦組織放置在1.5 ml Eppendorf管中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫簧项M骨于4%多聚甲醛溶液中固定，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4Micro-CT分析大鼠牙槽骨組織破壞情況 大鼠頜骨樣本經4%多聚甲醛溶液固定后，采用Micro-CT掃描，三維重建，用相應軟件測量每只大鼠雙側上頜第一磨牙釉牙骨質界(cemento-enamel junction, CEJ)至牙槽嵴頂?shù)木嚯x即為牙槽骨喪失量(alveolar bone loss, ABL),每顆實驗牙分別測量頰側和腭側近中、正中、遠中六個位點，取六個位點的均值作為該牙的牙槽骨喪失值。

1.2.5實時熒光定量PCR(qPCR)檢測大鼠牙齦組織和海馬組織中炎癥因子及海馬組織中TLR4/NF-κB信號通路關鍵因子mRNA表達 取部分凍存的牙齦組織和海馬組織，室溫下溶解，于預冷的PBS中清洗去除血漬，加入適量TRIzol試劑裂解組織，收集并測定RNA濃度，使用PrimeScriptTMRT Master Mix 逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板，GAPDH為內參基因，上PCR儀檢測，相對mRNA水平通過2-ΔΔCt方法定量計算。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.2.6ELISA檢測大鼠海馬組織中炎癥因子及Aβ40和Aβ42蛋白表達 取部分凍存的海馬組織，室溫下溶解，于預冷的PBS中清洗去除血漬，濾紙吸干，稱取重量，加入預冷的PBS(pH 7.4)，組織與PBS的質量體積比為1 ∶10，用玻璃研磨器將組織標本充分研磨(冰上操作)，4 ℃離心20 min(2 000～3 000 r/min)，仔細收集上清液，ELISA法檢測大鼠海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α及Aβ40和Aβ42的蛋白表達水平。

2 結果

2.1Pg形態(tài)學觀察肉眼觀Pg呈黑色，圓形凸起, 表面光滑；革蘭染色呈陰性桿菌，紅色。確認Pg無污染后，在厭氧環(huán)境下于BHI液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h， 12 000 r/min離心5 min，將離心后底部沉淀用無菌PBS重懸2次，將菌液濃度調整為1×108CFU/ml備用，稀釋后的菌液在15 min內完成接種。

圖2 Pg形態(tài)學觀察 A：肉眼觀；B：革蘭染色 ×100

2.2 實驗性牙周炎大鼠的牙槽骨吸收Micro-CT掃描圖像顯示，CP組與對照組相比，上頜第一磨牙牙槽骨高度明顯降低；腹腔注射TAK-242組的大鼠牙槽骨吸收程度較CP組明顯減少，見圖3A～C。牙槽骨喪失測量結果顯示，CP組的牙槽骨喪失量較對照組明顯增加(F=602.776，P<0.000 1)；腹腔注射TAK-242組大鼠牙槽骨喪失量較CP組明顯減少(F=524.042，P<0.000 1)(圖3D)。這些結果表明牙周炎模型的建立是成功的，腹腔注射TAK-242預處理可減少由結扎輔以涂菌所誘導的牙周炎導致的牙槽骨喪失。

圖3 Micro-CT所示大鼠左側上頜骨三維重建模型A:control組; B:CP組; C:CP+TAK242組

圖3D 大鼠上頜第一磨牙牙槽骨喪失量

2.3 實驗性牙周炎大鼠牙齦組織中促炎因子mRNA表達水平的變化如圖4所示，與對照組相比，CP+TAK-242組大鼠牙齦組織中各炎癥因子的mRNA表達水平均無統(tǒng)計學差異(FIL-6=0.076，P=0.792；FIL-1β=1.113，P=0.332；FTNF-α=0.601，P=0.468)；但與對照組相比，結扎和涂菌誘導可明顯上調實驗大鼠牙齦組織中炎癥因子的表達，差異有統(tǒng)計學意義(FIL-6=71.491，P<0.000 1；FIL-1β=218.941，P<0.000 1；FTNF-α=1 217.952，P<0.0001)；而腹腔注射TAK-242組可降低炎癥因子的表達，差異有統(tǒng)計學意義(FIL-6=54.902，P<0.000 1；FIL-1β=157.674，P<0.000 1；FTNF-α=72.380,P<0.000 1)。

圖4 實驗性牙周炎大鼠牙齦組織中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表達水平變化與Control組比較：****P<0.000 1；與CP組比較：####P<0.000 1

2.4 實驗性牙周炎大鼠海馬組織中促炎因子mRNA表達水平的變化如圖5所示，對照組與CP+TAK-242組大鼠海馬組織中各炎癥因子的mRNA表達水平均無統(tǒng)計學差異；與對照組相比，CP組大鼠海馬組織中炎癥因子的表達升高，且有統(tǒng)計學意義(FIL-6=335.140，P<0.000 1；FIL-1β=265.642，P<0.000 1；FTNF-α=74.089，P<0.001)；CP+TAK-242組的大鼠與CP組相比，炎癥因子的表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(FIL-6=105.213，P<0.000 1；FIL-1β=154.694，P<0.000 1；FTNF-α=68.954,P<0.000 1)。

圖5 實驗性牙周炎大鼠海馬組織中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表達水平變化 與Control組比較：***P<0.001，****P<0.000 1；與CP組比較：####P<0.000 1

2.5 實驗性牙周炎大鼠海馬組織中促炎因子蛋白表達水平的變化如圖6所示，與對照組相比，CP+TAK-242組大鼠海馬組織中各炎癥因子的蛋白表達無明顯變化；但CP組大鼠較對照組，海馬組織中炎癥因子的蛋白表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義(FIL-6=622.007，P<0.000 1；FIL-1β=302.341，P<0.000 1；FTNF-α=120.823，P<0.001)。與CP組相比，CP+TAK-242組炎癥因子的蛋白表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義(FIL-6=499.412，P<0.000 1；FIL-1β=263.800，P<0.000 1；FTNF-α=113.363,P<0.000 1)。

圖6 實驗性牙周炎大鼠海馬組織中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表達水平變化與Control組比較：****P<0.000 1；與CP組比較：####P<0.000 1

2.6 實驗性牙周炎大鼠海馬組織中TLR4/NF-κB信號通路關鍵因子mRNA表達水平的變化如圖7所示，與對照組相比，CP組大鼠海馬組織中該通路關鍵因子的mRNA表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義(FTLR4=86.983，P<0.0001；FCD14=174.724，P<0.0001；FNF-κB=25.822，P<0.001)；與CP組相比，CP+TAK-242組這些因子的表達降低，且差異有統(tǒng)計學意義(FTLR4=103.068，P<0.0001；FCD14=67.325，P<0.0001；FNF-κB=23.631,P<0.001)。

圖7 實驗性牙周炎大鼠海馬組織中TLR4/NF-κB信號通路關鍵因子TLR4、CD14和NF-κB mRNA表達水平變化與Control組比較：***P<0.001，****P<0.000 1；與CP組比較：###P<0.001，####P<0.000 1

2.7 實驗性牙周炎大鼠海馬組織中Aβ40和Aβ42蛋白表達水平的變化如圖8所示，CP組大鼠海馬組織中Aβ40的蛋白表達量高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(FAβ40=1.653，P=0.246)；CP+TAK-242組Aβ40的蛋白表達量雖低于CP組，但差異無統(tǒng)計學意義(FAβ40=1.348，P=0.290)。與對照組相比，CP組Aβ42的蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(FAβ42=30.152，P=0.002)；CP+TAK-242組Aβ42的蛋白表達較CP組降低，差異有統(tǒng)計學意義(FAβ42=17.222，P=0.006)。

圖8 實驗性牙周炎大鼠海馬組織中Aβ40和Aβ42蛋白表達水平變化與Control組比較：**P<0.01；與CP組比較：##P<0.01

3 討論

牙周炎作為細菌(包括其毒力因子)和宿主炎癥反應相互作用的結果，具有明顯的炎癥特征，炎癥程度越重，牙周組織破壞程度也越重[7]。隨著牙周醫(yī)學的發(fā)展，越來越多的研究表明牙周炎與全身慢性炎癥性疾病具有共同的潛在致病機制，牙周炎可能通過增加全身細胞因子的水平而成為全身疾病(如認知障礙)的重要危險因素[8]。

目前，牙周炎和AD的相互關系仍處于流行病學和臨床病例對照研究階段，潛在的病理機制尚未闡明。以往的動物實驗研究多采用由特定病原體感染或其毒力因子作用建立模型(如牙齦卟啉單胞菌及其毒力因子牙齦卟啉單胞菌脂多糖)，研究[9-10]表明腹腔注射或局部應用牙齦卟啉單胞菌脂多糖可通過激活TLR4/NF-κB信號通路引起實驗大鼠的認知功能障礙，但這些建模方式具有局限性，不能模擬臨床牙周炎的自然發(fā)展。該實驗通過結扎大鼠上頜第一磨牙輔以牙齦卟啉單胞菌接種這一公認的方法建立實驗性牙周炎大鼠模型，更類似于臨床牙周炎。實驗大鼠結扎后所有實驗牙均探診極易出血，探診深度增加；Micro-CT掃描結果顯示，實驗大鼠結扎后牙槽骨吸收明顯，說明牙周炎模型成功建立。

作為炎癥的主要觸發(fā)因素之一，TLR4/NF-κB信號通路在牙周炎的病理發(fā)展中起重要作用，被激活的NF-κB信號通路可以啟動細胞因子的轉錄及翻譯，從而釋放出大量的炎癥因子，抑制TLR4/NF-κB通路關鍵因子的活化可能是炎癥治療的作用靶點[2]。TAK-242作為TLR4信號傳導抑制劑，可以下調TLR4下游信號分子MyD88的表達，抑制炎癥因子的釋放，從而抑制炎癥進程[11]。該研究發(fā)現(xiàn)實驗性牙周炎大鼠海馬組織中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α及TLR4、CD14和NF-κB的表達水平增加， TAK-242 預處理可以減弱已被上調的上述因子的表達，說明實驗性牙周炎可上調大鼠腦組織內炎癥因子的表達，進而促進神經炎癥的發(fā)生。

AD最重要的病理變化之一是腦內Aβ異常沉積形成老年斑，Aβ40和Aβ42是最常見的兩種亞型，具有病理意義的Aβ42是淀粉樣斑塊的主要成分，Aβ40不會引起病理性積聚[6]。研究發(fā)現(xiàn)成年野生型小鼠在長期口服牙齦卟啉單胞菌脂多糖后出現(xiàn)神經退行性變和海馬組織中Aβ42的積聚[12]。該項研究發(fā)現(xiàn)實驗性牙周炎大鼠海馬組織中Aβ40的表達無明顯變化，但具有神經毒性的Aβ42的表達增加，腹腔注射TAK-242預處理可以逆轉這一變化。

該實驗結果顯示，通過結扎大鼠雙側上頜第一磨牙輔以接種牙齦卟啉單胞菌的方法成功建立的實驗性牙周炎大鼠模型，其海馬組織中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α及Aβ42的表達增加，而腹腔注射TAK-242預處理可降低這些因子的表達。TAK-242作為TLR4信號傳導抑制劑可以通過下調TLR4/NF-κB信號通路, 從而降低炎癥因子的釋放, 起到降低神經毒性的作用。該實驗為通過控制或減輕牙周炎癥從而緩解AD病理變化提供理論依據，為進一步探究牙周炎與AD的相互關系提供理論支持。