許 振，蔣海峰，張 磊，劉瀟一，董婷玉，檀學文，嚴尚學，常 艷，魏 偉

肺部疾病是常見疾病，其中肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)和類風濕關節(jié)炎合并間質(zhì)性肺病(rheumatoid arthritis with interstitial lung disease，RA-ILD)是難治疾病[1-2]，其特征是成纖維細胞異常增殖，細胞外基質(zhì)過度積累，炎癥損傷和組織結構破壞,最終導致肺瘢痕形成、肺功能不全和呼吸衰竭，嚴重影響呼吸系統(tǒng)功能及呼吸能力。成纖維細胞是肺間質(zhì)中最豐富的細胞類型，產(chǎn)生膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶等細胞外基質(zhì)。在維持肺結構和功能方面起著關鍵作用。成纖維細胞在損傷和炎癥部位的增多對于組織修復至關重要，α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)是成纖維細胞的特征蛋白，肺成纖維細胞受促纖維化細胞因子TGF-β1的刺激后，α-SMA的表達水平會明顯升高[3-5]。獼猴是最接近人的非人靈長類動物，其疾病發(fā)生的病理機制等相對于其他動物更接近于人，相比于小鼠、兔等實驗動物能更直接地反映疾病發(fā)生和發(fā)展的病理過程，因此分離得到的原代獼猴肺成纖維細胞對于研究肺纖維化、類風濕關節(jié)炎合并間質(zhì)性肺病等的病理機制至關重要[6-7]。該研究對兩種用于分離獼猴肺成纖維細胞的方法進行了比較。第一種使用膠原酶聯(lián)合消化+組織黏附法(后統(tǒng)稱為膠原酶消化法)，第二種是組織黏附法。此兩種方法均可用于從肺組織中分離成纖維細胞。通過比較這兩種方法，試圖摸索出獼猴肺成纖維細胞的最佳分離方法及條件，為進一步在獼猴肺成纖維細胞的體外模型中開展實驗提供更好的研究手段，為獲得更接近人的原代肺成纖維細胞提供方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取3～5歲普通級實驗獼猴，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所實驗動物中心。溫度20～26 ℃；日溫差≤4 ℃；相對濕度40%～70%。晝夜交替滿足獼猴作息時間，飼料、水不受限制，通過瓜果蔬菜補充營養(yǎng)，定時為獼猴播放音樂及視頻，嚴格遵守動物福利標準。實驗動物購自旌德縣皖南獼猴馴養(yǎng)繁殖基地，生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2020-001；實驗動物使用許可證號：SYXK(皖)2020-001。該實驗過程得到安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所動物倫理委員會批準(倫理批號：PT-2020-001)。

1.1 主要實驗試劑及儀器青鏈霉素溶液(100×) 、0.125% 胰蛋白酶(含EDTA)、DAPI 染色液、抗熒光猝滅封片液購自上海 Beyotime 公司; DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS) 購自以色列 Biological Industries公司; 凋亡試劑盒(AP105-60-kit,購自杭州聯(lián)科生物公司)；CCK-8(BS350A，購自合肥蘭杰柯科技有限公司)；α-SMA(兔抗單克隆抗體，ab32575，購自英國abcam公司)、GAPDH(兔抗單克隆抗體，美國Proteintech公司);BIO-RAD powerpack164-5070電泳儀(美國BIO-RAD公司)；Image Quant化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國GE公司)；倒置顯微鏡購自美國 GE Healthcare Life Sciences 公司; 實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司; 十色流式細胞分析儀購自美國 Beckman Coulter公司。

1.2 獼猴肺成纖維細胞分離培養(yǎng)方法

1.2.1取材 獲得獼猴肺組織后，取0.5 cm3體積的肺組織塊放于預冷的無菌0.9%氯化鈉溶液中，洗除血塊、表面結締組織和包膜后放于無菌EP管中，用無菌剪刀剪碎成小于1 mm3的組織塊，將剪碎的組織塊移至無菌的15 ml離心管中。

1.2.2組織黏附法 將剪碎的組織塊放于15 ml離心管中，直接用(含20%FBS，1%青霉素G鈉鹽，10 mg/ml硫酸鏈霉素)高糖DMEM重懸組織塊后用巴氏吸管將重懸的組織塊均勻黏附在無菌細胞瓶中，注意黏附的組織塊間隔大約1～2 mm。黏附組織塊的細胞瓶中加入2 ml 20%DMEM后垂直放于37 ℃培養(yǎng)箱中。4 h后緩慢將細胞瓶放倒培養(yǎng)。

1.2.3膠原酶聯(lián)合消化+組織黏附法 在裝有剪碎組織塊的15 ml離心管中加入2 ml的膠原酶(1 mg/ml Ⅰ型膠原酶+0.01 mg/ml Dnase1+RPMI-1640 培養(yǎng)基)和2 ml的0.125%胰酶消化液，并吹打3～4次后放于37 ℃恒溫箱中震蕩20 min，取出后靜置5 min，盡量用無菌吸管吸出膠原酶后加入(含20%FBS，1%青霉素G鈉鹽，10 mg/ml硫酸鏈霉素)高糖DMEM培養(yǎng)基，用上述相同方法將組織均勻黏附在無菌細胞瓶中。放于培養(yǎng)箱中4 h后加入2 ml 20%血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.3細胞培養(yǎng)及傳代 兩種方法在細胞瓶中將組織黏附后，待培養(yǎng)至第3天將培養(yǎng)基吸出，重新加入3 ml(含20%FBS，1%青霉素G鈉鹽，10 mg/ml硫酸鏈霉素)高糖DMEM。組織黏附法黏附的組織塊在第9～10 天可得到單層細胞，在超凈臺中吸出培養(yǎng)基，用無菌PBS洗兩遍盡量吹掉組織塊，加入0.125%胰酶消化1 min后加入含有血清的DMEM培養(yǎng)基，反復吹打9～10次將細胞吹下，將收集的細胞懸液過濾后以1 500 r/min離心5 min，棄上清液加入20%血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞轉(zhuǎn)移至新細胞瓶中，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d可生長至70%～80%。膠原酶消化法在第6 天，用上述方法消化過濾得到細胞，過濾后的細胞在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d即可生長至70%～80%。

1.3 肺成纖維細胞形態(tài)觀察與鑒定

1.3.1形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長狀況。

1.3.2免疫熒光法檢測α-SMA的表達 收集培養(yǎng)至第3代的細胞于24孔板中爬片24 h，室溫固定封閉，100 μl PBS稀釋α-SMA抗體4 ℃孵育一晚，第2天PBS洗三遍后加入熒光通道二抗孵育2 h，PBS洗三遍后加入DAPI室溫孵育8 min，最后取出爬片滴加抗熒光淬滅劑固定在載玻片上，用激光共聚焦顯微鏡觀察α-SMA蛋白的表達。

1.3.3流式檢測細胞的純度 消化收集第3代的肺成纖維細胞置1.5 ml EP管中，用PBS洗一遍后以50 μl PBS重懸細胞并加入α-SMA抗體孵育40 min，離心棄上清后50 μl PBS重懸加入通道二抗孵育30 min，離心去除上清后加入200 μl PBS在流式分析細胞儀中檢測肺成纖維細胞的比例。

1.3.4CCK-8檢測細胞活力 收集培養(yǎng)至第3代的細胞1×105個/孔接種于96孔板中。37 ℃培養(yǎng)24 h后加入刺激劑TGF-β1，6 h后96孔板中加入刺激劑的組和未加入刺激劑的組加入10 μl/孔CCK-8試劑,培養(yǎng)1 h后酶標儀檢測波長為450 nm處的吸光度值。

1.3.5Western blot檢測細胞α-SMA、IL-6和MMP-9的表達 收集細胞提取蛋白。配制10%的SDS-PAGE凝膠，上樣電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含0.05%吐溫20的PBS配制的5%脫脂牛奶37 ℃搖床封閉2 h，孵育一抗，4 ℃過夜，洗去一抗后，37 ℃孵育二抗后2 h后，洗去二抗，化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影。采用Image J圖像分析軟件進行結果分析，測得條帶的灰度值，計算各組的目的條帶和內(nèi)參GAPDH的比值以反映目的蛋白表達水平，比較各組間的差異。

1.3.6qPCR檢測IL-6、MMP-9的表達 收集細胞，提取細胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后檢測IL-6和MMP-9的表達。GAPDH(Rhesus monkey)F:5′-TGACAACAGCCTCAAGATCG-3′, R:5′-TGTGGTCA TGAGTCCTTCCA-3′； IL-6(Rhesus monkey)F:5′-CTC AGCCCTGAGAAAGGAGA-3′, R:5-ACCAGGCAAGT GTCCTCATT-3′；MMP-9(Rhesus monkey)F:5′-GAC AAGAAGTGGGGCTTCTG-3′，R:5′-CCGGCACTGAGG TATGATCT-3′。

1.4 流式檢測細胞凋亡待細胞培養(yǎng)至第3代時，用胰酶將細胞消化至EP管中，將上清培養(yǎng)液與胰酶消化下來的細胞用凋亡試劑盒在流式分析儀上檢測細胞凋亡。

2 結果

2.1 不同方法提取原代獼猴肺成纖維細胞的形態(tài)學觀察

2.1.1組織黏附法分離出的獼猴肺成纖維細胞的形態(tài)學觀察 組織黏附法培養(yǎng)24 h后(圖1A)，組織塊周圍未見細胞爬出。72 h后，組織塊周圍逐漸爬出少量小圓形發(fā)亮的細胞。第4 天(圖1B)，組織塊周圍細胞逐漸變成梭形，但細胞呈零星分布。第7天，爬出的細胞逐漸范圍擴大，細胞開始匯合生長，細胞開始全部變成長梭形，呈線性紡錘狀。培養(yǎng)10 天左右，細胞基本上長滿單層，占80%～90%，細胞大多數(shù)呈長梭形，少數(shù)呈多邊形細胞。傳代后的細胞接種于細胞瓶中48 h即可進入指數(shù)生長期，72 h后處于指數(shù)生長期，96 h生長可達到高峰。

2.1.2膠原酶消化法分離出的獼猴肺成纖維細胞的形態(tài)學觀察 膠原酶消化法黏附的組織塊培養(yǎng)24 h后，組織塊周圍逐漸爬出發(fā)亮的小圓形細胞(圖1E)。培養(yǎng)48 h后，組織塊周圍小圓形細胞開始逐漸變?yōu)殚L梭形或三角形的細胞。72 h時組織塊周圍爬出的細胞幾乎全部變成長梭形的細胞，爬出的細胞范圍逐漸擴大。第4天時爬出的細胞基本上單層融合(圖1F)，多數(shù)細胞可見核分裂現(xiàn)象并聚集成團生長。第6 天時細胞快速生長匯合，約占細胞瓶的80%～90%，細胞連接緊密變得細長類似紡錘體，胰酶消化傳代后的細胞接種于細胞瓶中30 min貼壁，24 h即可進入指數(shù)生長期，48 h后處于指數(shù)生長期，72 h生長可達到生長高峰。

圖1 組織黏附法和膠原酶消化法24 h、第4天、第3代、第8代培養(yǎng)獼猴肺成纖維細胞的形態(tài)學觀察 ×10

2.2 不同方法提取的原代獼猴肺成纖維細胞的鑒定

2.2.1流式檢測α-SMA表達水平 細胞用分析流式標記α-SMA，結果顯示兩種方法提取的獼猴肺成纖維細胞表達α-SMA的比例均為11%左右,見圖2A。

2.2.2免疫熒光檢測α-SMA表達水平及分布情況 分離的原代獼猴肺成纖維細胞用免疫熒光標記α-SMA鑒定細胞，免疫熒光結果顯示膠原酶消化提取的細胞表達α-SMA，主要分布在細胞質(zhì)中；而組織黏附法提取的細胞α-SMA表達呈強陽性，同樣也分布在細胞質(zhì)中。給予TGF-β1刺激后，膠原酶聯(lián)合消化的細胞α-SMA表達升高，而組織黏附法的細胞α-SMA表達變化不明顯，見圖2B。

圖2 肺成纖維細胞α-SMA表達水平A:肺成纖維細胞間標流式標記α-SMA抗體；B：肺成纖維細胞免疫熒光α-SMA蛋白熒光觀察

2.2.3凋亡試劑盒檢測細胞凋亡率 收集不同傳代周期點的細胞用凋亡試劑盒檢測結果表明(圖3)，兩種方法分離的細胞第2代和第3代的細胞凋亡率都在1%以下，第5代和第7代的凋亡率在2%左右。整體來看，兩種方法提取的獼猴肺成纖維細胞第1代到第8代都沒有明顯早期凋亡(第四象限)和凋亡(第一象限)，但是在第5代之后培養(yǎng)過程中死亡的細胞比較多(第二象限)。

圖3 肺成纖維細胞凋亡率檢測

2.2.4CCK-8檢測獼猴肺成纖維細胞的細胞活力 收集培養(yǎng)至第3代的細胞用CCK-8檢測細胞活力。結果表明，膠原酶消化提取細胞的細胞活力高于組織黏附法提取的細胞。細胞同時加了TGF-β1刺激劑后，組織黏附法組的細胞加了刺激劑后細胞活力升高(F<13.556,P<0.05)。而膠原酶消化組的細胞活力與不加刺激劑組比較，細胞活力升高(F<15.007,P<0.01)，見圖4。

圖4 肺成纖維細胞的細胞活力檢測

2.5 Western blot檢測獼猴肺成纖維細胞的α-SMA的表達提取出的細胞加入TGF-β1刺激，檢測α-SMA蛋白的表達水平。結果顯示，兩種方法提取的細胞給予TGF-β1刺激后，與未加刺激的細胞相比α-SMA蛋白表達上升，膠原酶消化得到的細胞與加入刺激后相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5B。

圖5 獼猴肺成纖維細胞α-SMA蛋白表達

2.6 qPCR檢測獼猴肺成纖維細胞MMP-9、IL-6基因表達提取兩種細胞的總RNA，qPCR檢測了MMP-9、IL-6 mRNA的表達，結果顯示，兩種方法提取的細胞都表達MMP-9和IL-6。膠原酶消化提取的細胞和組織黏附法提取的細胞MMP-9 mRNA表達水平基本無變化，IL-6 mRNA表達水平同樣無明顯差異。Western blot結果和PCR結果一致，兩種蛋白在細胞上都有表達且無明顯差異。

圖6 獼猴肺成纖維細胞MMP-9、IL-6表達

3 討論

人的肺組織結構復雜，分為五個肺葉，肺實質(zhì)由許多不同的細胞組成，其中肺成纖維細胞是肺間質(zhì)中最豐富的細胞類型[8]。成纖維細胞主要功能是產(chǎn)生Ⅰ型膠原蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶等細胞外基質(zhì)。因此它們在維持肺結構和功能方面起著關鍵作用。肺部損傷和炎癥部位的成纖維細胞對于組織修復至關重要。然而，成纖維細胞的增多會導致組織功能異常，并可能導致包括肺纖維化、慢性阻塞性肺病和哮喘在內(nèi)的疾病。一直以來，動物疾病模型是我們研究間質(zhì)性肺病診斷、機制及藥物治療必要手段，由于小鼠等實驗動物與人的肺在大小、結構及分子水平的差異，迫切需要開發(fā)與人類相接近的肺模型。而獼猴是最接近人的非人靈長類動物，在許多疾病發(fā)生發(fā)展的病理機制中與人類具有很多相似之處，相較于大小鼠等動物具有更好的臨床意義[9-10]。目前關于肺成纖維細胞功能的大部分知識都來自于從肺組織中分離出原代成纖維細胞的研究，如何在獼猴身上提取肺組織中的成纖維細胞對于今后在體外模型上開展相關實驗具有重要意義。

前期查詢了關于提取小鼠肺成纖維細胞的方法，但小鼠肺成纖維細胞在數(shù)量、功能和酶含量等與人存在異質(zhì)性[11]，獼猴肺成纖維細胞可以較好的在體外實驗中代替人肺成纖維細胞。本實驗總結了兩種方法提取獼猴肺組織中的成纖維細胞并對此兩種方法加以比較，試圖為選擇出更好的提取獼猴肺成纖維細胞的方法提供依據(jù)。組織黏附法是一種相對簡單的方法，組織不加處理直接剪碎后黏附貼壁，但需要大約10 d才可得到單層細胞，由于細胞從組織中爬出時間較長，組織在長期培養(yǎng)中存在易污染、傳代后細胞生長周期相對過長、生存代數(shù)少等缺點。膠原酶消化法是一種先膠原酶消化后再貼壁的方法，在6 d 左右即可得到單層細胞，消化傳代后得到的細胞生長迅速，傳代周期長(可傳代8～9代)。但是需注意膠原酶消化過程中時間不宜太長，一般消化20～30 min即可，消化時間過長或濃度過高等因素都有可能損傷細胞，使組織塊難以貼壁或細胞難以爬出。α-SMA是肺成纖維細胞的標志性蛋白，也是檢測肺成纖維細胞功能性實驗的主要手段。本文利用免疫熒光和Western blot實驗結果表明組織黏附法得到的細胞α-SMA陽性表達更多，在TGF-β1刺激后α-SMA的表達同膠原酶消化得到的細胞刺激后相比上升趨勢不明顯。組織黏附法得到的細胞傳代到第5代左右細胞體積變大、細胞狀態(tài)差細胞活力低。肺組織中MMP-9升高能夠參與肺內(nèi)炎癥修復和加速纖維化，另外IL-6水平下降后在小鼠模型中也可以加速肺部纖維化的發(fā)展[12]，實驗結果顯示兩種方法提取的細胞都有表達MMP-9 和IL-6，且表達無明顯差異。膠原酶消化后得到的細胞表達α-SMA，TGF-β1刺激后α-SMA表達呈強陽性，是一種典型成纖維細胞形態(tài)特征，且提取出的獼猴肺成纖維細胞活性較好。

綜上所述，本實驗確立了兩種可以分離出獼猴肺成纖維細胞的方法，分別是組織黏附法和膠原酶聯(lián)合消化后組織塊黏附法。通過多種研究方法比較相關的細胞特性，明確了膠原酶聯(lián)合消化后組織黏附法分離出的獼猴肺成纖維細胞具有典型的形態(tài)特征和成纖維細胞的功能，并且用此法分離出的細胞活性更好，是一種較為可靠快速提取原代獼猴肺成纖維細胞的方法，為今后研究肺疾病獲得更接近人的原代肺成纖維細胞提供方法，有助于為闡明人類肺部發(fā)育和疾病的潛在機制提供手段。