董曉玉，鐘 濤，葉元滋，鄭美娟，沈繼龍

肺癌嚴(yán)重威脅人類健康，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，占全球因癌癥死亡人數(shù)的五分之一[1]。2020年美國(guó)新增肺癌患者約12.9萬(wàn)人，其中肺癌病死率占全部因癌癥致死率的45%，位居病死率首位[2]。肺癌患者中大約80%～85%確診為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)和肺鱗狀細(xì)胞癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)是最常見(jiàn)的兩種組織學(xué)亞型。早期發(fā)現(xiàn)NSCLC對(duì)于術(shù)后良好預(yù)后至關(guān)重要，因?yàn)榉伟㊣b期的5年生存率可達(dá)68%[3]，因此腫瘤標(biāo)志物的監(jiān)測(cè)對(duì)于肺癌的早期診斷和篩查具有優(yōu)勢(shì)。熱休克蛋白(heat shock protein 90α，HSP90α)是近年來(lái)較熱門的腫瘤篩查指標(biāo)，它是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，可在一系列癌癥中高表達(dá)，有助于癌細(xì)胞的增殖、侵襲，例如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、卵巢癌等，HSP90α可成為癌癥的一個(gè)潛在標(biāo)識(shí)物[4]。該文主要探索HSP90α及癌組織基因HSP90AA1的表達(dá)在肺癌早期診斷，以及療效和預(yù)后中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2019年8月—2021年8月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院住院的109例肺癌患者為實(shí)驗(yàn)組，其中男81例，女28例，年齡41～87(69.62±9.99)歲。本研究肺癌納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均在初診時(shí)行纖維支氣管鏡或肺穿刺等經(jīng)病理確診；未經(jīng)化療、放療及手術(shù)的首診患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤患者。依據(jù)病理肺癌患者中鱗癌42例，腺癌41例，小細(xì)胞肺癌23例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌2例，合并兩種類型的肺癌(左肺鱗癌，右肺小細(xì)胞癌)1例。肺部炎癥患者(包括肺部、支氣管感染)36例為參照組，所有患者均符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男27例，女9例，年齡33～89(64.42±14.43)歲；對(duì)照組為安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院體檢中心健康體檢者30例，其中男14例，女16例，年齡48～92(58.73±8.73)歲。各組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。入選對(duì)象或家屬均簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào)：KYXM-202110-015)。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本 所有入組人員均空腹靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝，用于HSP90α和異常糖鏈蛋白(TAP)檢測(cè)；另取靜脈血4 ml，無(wú)添加劑，離心(4 000 r/min，8 min)后取血清進(jìn)行腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀MAGLUMI 2000 Plus及配套試劑盒檢測(cè)鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(squamous cell carcinoma associated antigen，SCC)，其參考區(qū)間臨界值2.5 ng/ml為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)；羅氏E601電化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑盒檢測(cè)胃泌素釋放肽前體(prn-gastrinreleasing peptide，ProGRP)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、細(xì)胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment，Cyfra21-1)、糖類抗原(carbohydrate antigen，CA72-4)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)，其參考區(qū)間臨界值分別為85.7 pg/ml、5.0 ng/ml、3.3 ng/ml、8.2 U/ml、24.0 ng/ml為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)；試劑為浙江瑞生醫(yī)療科技有限公司采用凝集法檢測(cè)TAP，其參考區(qū)間臨界值121.0 μm2為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)；試劑為煙臺(tái)普羅吉生物科技發(fā)展有限公司采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)HSP90α，其參考區(qū)間臨界值82.06 ng/ml為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3HSP90AA1數(shù)據(jù) 通過(guò)癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)下載數(shù)據(jù)，分析490例肺腺癌和485例肺鱗癌患者癌組織與癌旁正常組織的HSP90AA1表達(dá)。通過(guò)Survminer包中surv-cutpoint函數(shù)計(jì)算得出HSP90AA1最優(yōu)分界點(diǎn)，將腺癌、鱗癌分為高低兩組，比較兩組HSP90AA1與患者臨床參數(shù)的關(guān)系，同時(shí)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，探究肺癌患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組、參照組、對(duì)照組HSP90α的比較三組間血清HSP90α水平比較有意義(Z=77.69，P<0.01)實(shí)驗(yàn)組高于參照組和對(duì)照組(P<0.01)，而參照組和對(duì)照組間無(wú)差異，見(jiàn)圖1。以炎癥組和體檢組為陰性組，肺癌組為陽(yáng)性組作ROC曲線，判斷HSP90α在肺癌中的診斷效能，其曲線下面積為0.898(0.850，0.945)。以HSP90α>82.06 ng/ml為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，其診斷肺癌的靈敏度為79.80%，特異度為97.10%，見(jiàn)圖2。

圖1 實(shí)驗(yàn)組、參照組、對(duì)照組HSP90α的比較

圖2 HSP90α診斷肺癌的ROC曲線與對(duì)照組比較：**P<0.01；與炎癥組比較：##P<0.01

2.2 實(shí)驗(yàn)組HSP90α水平與肺癌其他臨床參數(shù)的關(guān)系血清HSP90α在NSE陽(yáng)性患者中表達(dá)高于NSE陰性者(χ2=6.594，P<0.05)；HSP90α與患者的其他臨床參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性，見(jiàn)表1。

表1 血清HSP90α水平與肺癌其他臨床指標(biāo)的關(guān)系(n=109)

2.3 實(shí)驗(yàn)組HSP90α水平與療效的關(guān)系肺癌患者在治療過(guò)程中，持續(xù)監(jiān)測(cè)血清HSP90α水平，當(dāng)影像學(xué)檢查提示腫瘤組織縮小或臨床病情緩解，HSP90α水平較初診結(jié)果降低(t=4.428，P<0.01)；影像學(xué)檢查提示腫瘤組織進(jìn)一步增大或有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提示病情進(jìn)展，HSP90α水平較初診結(jié)果增高(t=3.173，P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 各時(shí)期血清HSP90α水平

2.4 血清HSP90α水平在肺腺癌、肺鱗癌、小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)血清HSP90α水平在三組間表達(dá)有意義(Z=6.058，P<0.05)；腺癌組為92.88(62.13，122.61)ng/ml，其表達(dá)低于鱗癌組104.30(85.82，141.44)ng/ml和小細(xì)胞肺癌組123.73(89.64，135.08)ng/ml(P<0.05)，而鱗癌組和小細(xì)胞肺癌組間血清HSP90α水平無(wú)差異(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 血清HSP90α水平在肺腺癌、肺鱗癌、小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與腺癌組比較：*P<0.05

2.5 HSP90AA1在肺腺癌和肺鱗癌組織中的表達(dá)HSP90α由基因HSP90AA1表達(dá)，通過(guò)TCGA分析490例肺腺癌和485例肺鱗癌患者癌組織與癌旁正常組織的HSP90AA1表達(dá)。肺腺癌和鱗癌患者，癌組織中HSP90AA1表達(dá)均高于癌旁(F=11.61，P<0.01；F=51.28，P<0.01)；腺癌組織中HSP90AA1水平表達(dá)低于鱗癌組(F=58.36，P<0.01)，見(jiàn)圖5。由于小細(xì)胞肺癌發(fā)病率較低，TCGA沒(méi)有足夠的數(shù)據(jù)，故HSP90AA1在小細(xì)胞肺癌組未進(jìn)行分析。

圖5 HSP90ΑA1在肺腺癌和肺鱗癌組織中的表達(dá)

2.6 肺癌患者臨床參數(shù)與HSP90AA1表達(dá)的分析通過(guò)Survminer包中surv-cutpoint函數(shù)計(jì)算得出HSP90AA1最優(yōu)分界點(diǎn)，將腺癌、鱗癌分為高低組，比較HSP90AA1在癌組織中高表達(dá)組和低表達(dá)組與患者臨床參數(shù)的關(guān)系。兩組患者HSP90AA1表達(dá)水平與年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤殘余均無(wú)關(guān)。腺癌患者的生存狀態(tài)、疾病進(jìn)展與HSP90AA1表達(dá)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表2；鱗癌患者的生存狀態(tài)與癌組織中HSP90AA1表達(dá)無(wú)關(guān)，而疾病進(jìn)展與之相關(guān)(P<0.01)，見(jiàn)表3。提示癌組織HSP90AA1高表達(dá)者易復(fù)發(fā)。

表2 腺癌HSP90AA1與臨床參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

表3 鱗癌HSP90AA1與臨床參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

2.7 HSP90AA1在癌組織中的表達(dá)水平與患者預(yù)后評(píng)估通過(guò)K-M生存曲線，對(duì)患者的整體生存率(OS)、無(wú)病生存率(DFI)進(jìn)行分析，腺癌患者HSP90AA1高表達(dá)者OS和DFI均低于低表達(dá)組(P<0.05)，而鱗癌患者癌組織HSP90AA1表達(dá)與其預(yù)后沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但高表達(dá)者無(wú)病生存期有降低趨勢(shì)，見(jiàn)圖6。

圖6 HSP90AA1在癌組織中的表達(dá)水平對(duì)患者的預(yù)后分析A：肺腺癌患者的OS分析；B：肺腺癌患者的DFI分析；C：肺鱗癌患者的OS分析；D：肺鱗癌患者的DFI分析

2.8 HSP90AA1表達(dá)水平是肺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素單因素分析顯示肺腺癌的TNM分期、腫瘤殘余、HSP90AA1表達(dá)水平是患者的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05)，而患者年齡、性別與預(yù)后不相關(guān)(P>0.05)；將上述因素納入多因素Cox回歸模型分析，TNM分期、腫瘤殘余、HSP90AA1的高表達(dá)是肺腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05)，見(jiàn)表4。肺鱗癌患者的TNM分期(Ⅲ期、Ⅳ期)、HSP90AA1表達(dá)水平是患者的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05)，而患者年齡、性別、TNM分期(I期、Ⅱ期)、腫瘤殘余與預(yù)后不相關(guān)(P>0.05)；多因素Cox回歸模型分析顯示鱗癌患者的TNM分期(Ⅲ期、Ⅳ期)、HSP90AA1表達(dá)水平是肺磷癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，見(jiàn)表5。

表4 影響肺腺癌患者OS的單因素和多因素Cox回歸分析(n=490)

表5 影響肺鱗癌患者OS的單因素和多因素Cox回歸分析(n=485)

3 討論

HSP存在于所有生物體中，是一種高度保守的ATP依賴性分子伴侶，它參與蛋白質(zhì)的重塑和激活，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)翻譯后的折疊和穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖[5]。HSP90底物蛋白大多是過(guò)度表達(dá)或突變的基因，如p53基因、表皮生長(zhǎng)因子受體、間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子等蛋白[6]，因此HSP90促進(jìn)惡性腫瘤且獲得耐藥性，亦被稱作“致癌成癮基因”[7]。HSP90有HSP90α和HSP90β兩個(gè)亞型，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)、外水平極低；當(dāng)機(jī)體微環(huán)境處于缺氧、損傷、氧化等狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)HSP90α和HSP90β釋放到細(xì)胞外，僅HSP90α可變異分泌，由腫瘤細(xì)胞持續(xù)分泌至細(xì)胞外[8]。故檢測(cè)HSP90α及其特異性抗體水平在癌癥診斷中發(fā)揮重要作用。

該研究比較了肺癌組、肺部炎癥組、健康對(duì)照組的血清HSP90α水平，肺癌患者HSP90α水平顯著高于其他兩組(P<0.01)；ROC曲線亦表明HSP90α在肺癌中有較高的診斷價(jià)值。近年多項(xiàng)研究[9-10]揭示HSP90α在肺癌患者的血清、癌組織中均上調(diào)，且其上調(diào)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)；相反，抑制Hsp90可通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)通路抑制癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移。一份包含2 247名患者的隊(duì)列研究[11]顯示肺癌患者血漿HSP90α水平顯著升高，且與患者分期相關(guān)。HSP90α與肺癌其他輔助診斷標(biāo)志物進(jìn)行比較，109例肺癌患者86例HSP90α陽(yáng)性，占比78.89%，除Cyfra21-1陽(yáng)性率(80.73%)，其余指標(biāo)陽(yáng)性率比均低于HSP90α；有3例患者肺癌篩查指標(biāo)均陰性，僅HSP90α陽(yáng)性，可見(jiàn)HSP90α對(duì)肺癌的輔助診斷有臨床價(jià)值。HSP90α聯(lián)合傳統(tǒng)肺癌輔助標(biāo)志物可提高其檢出率，從而早發(fā)現(xiàn)早治療[12]。另有研究報(bào)道[13]檢測(cè)患者的肺泡灌洗液，HSP90α的診斷效率優(yōu)于Cyfra21-1和NSE。該研究發(fā)現(xiàn)腺癌組血清HSP90α水平相對(duì)于鱗癌、小細(xì)胞肺癌較低，這與其基因HSP90AA1在腫瘤組織中的表達(dá)相似。多項(xiàng)研究顯示HSP90α在NSCLC患者中比在對(duì)照個(gè)體中更豐富[6]。許 露 等[14]報(bào)道HSP90α聯(lián)合患者臨床資料對(duì)NSCLC的EGFR突變有預(yù)測(cè)價(jià)值。

由于該研究臨床資料有限，為獲得更多HSP90α在肺癌中表達(dá)的相關(guān)資料，通過(guò)TCGA分析了基因HSP90AA1在近千例肺癌組織中的表達(dá)。癌組織中HSP90AA1表達(dá)均高于癌旁(P<0.01)，且腺癌組織中HSP90AA1水平表達(dá)低于鱗癌組織(P<0.01)， Wang et al[15]報(bào)道HSP90AA1是促進(jìn)肺鱗癌進(jìn)展的相關(guān)基因。數(shù)據(jù)分析顯示HSP90AA1在肺腺癌和鱗癌組織中的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤分期均無(wú)關(guān)；腺癌患者的生存狀態(tài)與癌組織中HSP90AA1表達(dá)相關(guān)，且HSP90AA1高表達(dá)患者OS和DFI均降低；肺鱗癌患者的生存分析顯示與HSP90AA1高表達(dá)雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但整體有降低的趨勢(shì)。單因素和多因素Cox回歸分析亦發(fā)現(xiàn)HSP90AA1的表達(dá)水平是肺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。從HSP90AA1的基因表達(dá)可以推斷出HSP90α與肺癌患者的生存和預(yù)后相關(guān)，但仍需大量的臨床數(shù)據(jù)支持。

該研究持續(xù)監(jiān)測(cè)肺癌患者治療過(guò)程中血清HSP90α水平，當(dāng)患者腫瘤組織縮小或病情緩解期HSP90α水平較初診結(jié)果降低；反之則增高?？梢?jiàn)血清HSP90α水平可以監(jiān)測(cè)腫瘤患者的療效。Zhong et al[6]研究結(jié)果顯示HSP90α可被認(rèn)為是晚期NSCLC化療的有價(jià)值預(yù)測(cè)因子，其水平與化療后腫瘤緩解呈正相關(guān)。Shi et al[11]亦報(bào)道HSP90α可以預(yù)測(cè)肺癌患者對(duì)化療的反應(yīng)。

綜上所述，HSP90α及HSPAA1在肺癌患者中高表達(dá)，當(dāng)患者病情緩解，血清HSP90α水平降低，反之則增高；癌組織HSPAA1高表達(dá)患者預(yù)后不良。HSP90α可作為肺癌的一種輔助診斷指標(biāo)，以及對(duì)肺癌的進(jìn)展、療效和預(yù)后觀察具有一定的臨床價(jià)值。這些為肺癌治療的新方法—HSP90α抑制劑作為靶向藥物提供了理論依據(jù)，一系列HSP90α抑制劑的設(shè)計(jì)、合成，目前已取得突破性的進(jìn)展，有望應(yīng)用于臨床。