程慧欣，白苗苗，沈振國(guó)，季華鋒，張 政，邢 田，王元銀,3

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(temporomandibular joint osteoarthritis，TMJ-OA)是一種以下頜髁突軟骨(mandibular condylar cartilage，MCC)退變?yōu)樘卣鞯倪M(jìn)行性退行性關(guān)節(jié)疾病[1]，患者主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、下頜運(yùn)動(dòng)異常及功能障礙。目前對(duì)于TMJ-OA的臨床治療方案多以對(duì)癥治療為主，尚無(wú)有效的預(yù)防和根治措施。血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1(serum-and glucocorticoid-induced kinase 1，SGK-1)作為絲/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一，參與離子通道調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖分化、自噬抑制等多種臨床生理和病理過(guò)程[2]。近年來(lái)有研究[4-6]表明，SGK-1在膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)及外周神經(jīng)系統(tǒng)的痛覺(jué)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用，但SGK-1在TMJ-OA中的作用尚無(wú)研究報(bào)道。本研究旨在探究SGK-1是否參與調(diào)控TMJ-OA軟骨破壞及以痛覺(jué)傳導(dǎo)進(jìn)程，以期為臨床預(yù)防和治療TMJ-OA提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠16只體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，保持室溫(22±2)℃，濕度(50±10)%，自由進(jìn)食水，每12 h變換晝夜節(jié)律，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，本實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)驗(yàn)方法均符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理準(zhǔn)則(動(dòng)物倫理批號(hào)：LLSC20190123)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料碘乙酸鈉(monosodium iodoacetate,MIA)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)；qRT-PCR引物( 上海生工生物工程股份有限公司)；擴(kuò)增試劑盒(中國(guó)南京諾唯贊公司)；超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)性大鼠TMJ-OA模型建立 將16只6周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為兩組，即TMJ-OA組和Control組。按3 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉，雙側(cè)TMJ區(qū)域消毒，以大鼠外耳道和眼角連線上，距外耳道約3 mm處，相當(dāng)于顴弓下方作為進(jìn)針點(diǎn)，向上向前向內(nèi)，抵骨壁后后退后退約1 mm，回抽無(wú)血后，雙側(cè)關(guān)節(jié)腔分別注射50 μl MIA(10 mg/ml)，留針1 min，Control組雙側(cè)關(guān)節(jié)腔按同樣的方法，注射等量0.9%氯化鈉溶液，見(jiàn)圖1。造模后28 d，過(guò)量麻醉處死大鼠，分別取各組大鼠左側(cè)完整TMJ及三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglion，TG)用于HE染色和番紅固綠染色，取右側(cè)MCC及TG用于qRT-PCR。

圖1 TMJ-OA動(dòng)物模型構(gòu)建

1.3.2行為學(xué)檢測(cè) 采用von-Frey毛刷測(cè)定大鼠頭退縮閾值(head withdrawal threshold，HWT)，分別在造模前3 d測(cè)定大鼠基礎(chǔ)閾值，篩除過(guò)于遲鈍或敏感的大鼠，并在造模后1 、7、14、21、28 d測(cè)定大鼠HWT值變化；檢測(cè)HWT前，將大鼠分別置于不同小籠中適應(yīng)30 min，待大鼠安靜后，用von-Frey毛刷按照從小到大的力度刺激TMJ區(qū)域，每個(gè)力度重復(fù)刺激10次，以出現(xiàn)至少6次頭退縮，或抓撓TMJ區(qū)域視為陽(yáng)性，記錄最小陽(yáng)性值作為HWT值。

1.3.3HE染色 將取出的完整左側(cè)TMJ在4%多聚甲醛中固定24 h后，10%EDTA脫鈣30 d，至探針可以輕松穿過(guò)組織，然后常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色；左側(cè)TG多聚甲醛中固定24 h后，直接脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色，在顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.3.4番紅固綠染色 將左側(cè)TMJ石蠟切片脫蠟，脫水，經(jīng)固綠、番紅染液染色后快速脫水，封片，顯微鏡下觀察。

1.3.5qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 將右側(cè)MCC和TG分別在液氮中研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移至無(wú)酶EP管， TRIzol法提取RNA，DEPC水溶解，測(cè)定總RNA濃度、純度，定量后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，SYBR法擴(kuò)增，用2-ΔΔCt法計(jì)算，β-actin校準(zhǔn)。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 各基因qRT-PCR引物序列一覽表

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果Control組和TMJ-OA組大鼠體質(zhì)量變化無(wú)明顯差異(t=4.76，P>0.05)(圖2)；Control組大鼠HWT值未見(jiàn)明顯變化，TMJ-OA組HWT值低于Control組 [ Control組(21.53 ± 0.72)g，TMJ-OA組(12.29 ± 3.46)g ]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.61，P<0.05)，且1 d后即出現(xiàn)HWT降低(t=4.29，P<0.001)，約在7 d左右達(dá)到閾值最低點(diǎn)(t=5.64，P<0.000 1)，此后HWT值出現(xiàn)緩慢上升，但是28 d左右閾值仍然明顯低于Control組(t=3.17，P<0.05)，表明TMJ-OA組大鼠出現(xiàn)機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏，見(jiàn)圖3。

圖2 大鼠體質(zhì)量變化

圖3 大鼠HWT變化

2.2 組織病理學(xué)結(jié)果

2.2.1TMJ組織病理學(xué)變化 取出大鼠MCC后肉眼可見(jiàn)Control組大鼠MCC表面光滑透亮， TMJ-OA組MCC表面缺損，粗糙失去光澤(圖4)。HE染色結(jié)果顯示(圖5A、B)，Control組大鼠MCC由層次分明的四層組成：纖維層、增殖層、肥大層、鈣化軟骨層。注射MIA 28 d后，TMJ-OA組大鼠出現(xiàn)典型的骨關(guān)節(jié)炎樣病變：MCC表面部分缺損，軟骨纖維化，纖維層部分細(xì)胞核丟失(黑色箭頭)，肥大層變薄甚至消失(綠色箭頭)，細(xì)胞層次紊亂、界限不清(黃色箭頭)，出現(xiàn)無(wú)細(xì)胞區(qū)(紅色箭頭)，軟骨細(xì)胞簇形成(白色箭頭)。番紅固綠染色結(jié)果顯示(圖4C、D)，Control組大鼠MCC肥大細(xì)胞層基質(zhì)均勻紅染；TMJ-OA組軟骨基質(zhì)淡染，甚至部分區(qū)域紅染消失(黑色箭頭)，表明軟骨受到損傷，軟骨細(xì)胞釋放過(guò)量蛋白多糖，使軟骨基質(zhì)分布不均。

圖4 大鼠髁突大體觀A：Control組；B：TMJ-OA組

圖5 TMJ組織病理學(xué)變化 ×40

2.2.2TG組織病理學(xué)變化 Control組大鼠 TG神經(jīng)纖維排列整齊緊密，施萬(wàn)細(xì)胞分布均勻。注射MIA 28 d后，TMJ-OA組神經(jīng)纖維排列紊亂松散(黃色箭頭)，出現(xiàn)空泡樣變，即脫髓鞘改變(紅色箭頭)，施萬(wàn)細(xì)胞增多(綠色箭頭)等(圖6)。

圖6 TG組織病理學(xué)變化 HE染色 ×400A：Control組；B：TMJ-OA組

2.3 大鼠MCC中mRNA表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)大鼠MCC中SGK-1、IL-1β、環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)-2、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases ，MMP)-13 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示：與Control組相比，TMJ-OA組SGK-1(t=2.21，P<0.05)、IL-1β(t=2.81，P<0.05)、COX- 2 (t=3.11，P<0.05)、MMP-13(t=3.21，P<0.01)的mRNA表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7)。

圖7 大鼠MCC中mRNA表達(dá)與Control組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4 大鼠TG中mRNA表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)TG中SGK-1、COX-2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示：與Control組相比，TMJ-OA組SGK-1(t=4.76，P<0.01)、COX-2(t=2.76，P<0.05) mRNA的表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖8)。

圖8 大鼠TG mRNA表達(dá) 與Control組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

TMJ-OA特征是細(xì)胞應(yīng)激和細(xì)胞外基質(zhì)降解，表現(xiàn)為局部炎癥及軟骨損傷。本研究參照Wang et al[7]的方法通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)局部注射MIA構(gòu)建大鼠TMJ-OA模型，大體觀及組織病理學(xué)結(jié)果顯示MIA注射可引起OA特征性改變，與臨床TMJ-OA患者具有相似的組織病理變化[1, 8]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β及COX-2在MCC中高表達(dá)，提示MIA可以引起MCC炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷，這與臨床患者和其他動(dòng)物模型疾病進(jìn)程相一致[9-10]。軟骨細(xì)胞主要功能是合成膠原蛋白等對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行補(bǔ)充，MMP通過(guò)分解Ⅱ型膠原維持TMJ的生理結(jié)構(gòu)的平衡；在本研究中，TMJ-OA組軟骨基質(zhì)淡染，同時(shí)MCC中MMP-13 mRNA高表達(dá)，推測(cè)可能是在炎性微環(huán)境下，軟骨細(xì)胞損傷，產(chǎn)生細(xì)胞因子可能刺激MMPs等的合成，加重軟骨基質(zhì)降解，從而加劇了OA 的發(fā)展。

TMJ關(guān)節(jié)區(qū)疼痛是TMJ-OA患者最亟待解決的問(wèn)題，TG作為頭面部外周痛覺(jué)信號(hào)樞紐接收TMJ軟骨下骨及滑膜組織中游離神經(jīng)末梢傳導(dǎo)的神經(jīng)沖動(dòng)，并將它們上傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生疼痛。本研究中TMJ-OA組大鼠HWT顯著降低，且TG神經(jīng)纖維出現(xiàn)顯著脫髓鞘改變，形成慢性疼痛損傷。有研究指出，氧化應(yīng)激可能直接損害神經(jīng)元功能或?qū)е履z質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活，這可能有助于神經(jīng)退行性疾病中的慢性持續(xù)性炎癥及神經(jīng)元功能障礙[11]，在高糖誘導(dǎo)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型中，抑制COX-2 的表達(dá)可減輕神經(jīng)元細(xì)胞的損傷和氧化應(yīng)激水平[12]，而在TMJ-OA模型中TG內(nèi)COX-2的表達(dá)鮮有報(bào)道，本研究結(jié)果顯示COX-2在TMJ-OA組TG內(nèi)表達(dá)顯著上調(diào)。盡管MCC中無(wú)神經(jīng)分布，但發(fā)生TMJ-OA時(shí)，持續(xù)的炎癥狀態(tài)、關(guān)節(jié)內(nèi)炎性因子誘導(dǎo)TG神經(jīng)元細(xì)胞損傷及神經(jīng)遞質(zhì)的變化也可能對(duì)疼痛的放大和遷延具有促進(jìn)作用。

SGK-1 是Webster et al[13]在對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)的差異篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)絲/蘇氨酸蛋白激酶。近年來(lái)研究報(bào)道SGK-1與KOA的軟骨破壞相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，臨床患者和小鼠KOA模型中，損傷的軟骨細(xì)胞高表達(dá)SGK-1，敲低軟骨細(xì)胞SGK-1基因表達(dá)后，受到炎癥刺激的軟骨細(xì)胞增殖明顯，且膠原合成增加[4-5]。盡管同為關(guān)節(jié)軟骨，TMJ軟骨與膝關(guān)節(jié)軟骨具有不同的組織結(jié)構(gòu)：TMJ是纖維軟骨，由Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白組成[14]。本研究發(fā)現(xiàn)與Control組相比，TMJ-OA組MCC中SGK-1的mRNA表達(dá)水平上調(diào)。除了參與炎癥免疫性疾病的病理過(guò)程，SGK-1還與學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)元興奮、中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病相關(guān)；研究發(fā)現(xiàn)，SGK-1可以通過(guò)促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7上調(diào)從而誘導(dǎo)慢性手術(shù)后疼痛，抑制SGK-1減輕周?chē)鷤Ω惺芷髦蠳av1.7的失調(diào)可能是防止慢性手術(shù)后疼痛向中樞神經(jīng)痛發(fā)展的有效途徑[6]。但目前SGK-1在TG中是否表達(dá)尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)TMJ-OA組TG中SGK-1的表達(dá)水平上調(diào)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SGK-1通過(guò)關(guān)節(jié)局部軟骨破壞和炎性疼痛傳導(dǎo)兩種途徑參與TMJ-OA的病理過(guò)程。

綜上所述，MIA關(guān)節(jié)內(nèi)注射可以得到與TMJ-OA患者相似的病理表現(xiàn)和疼痛癥狀，SGK-1在破壞的MCC中和損傷的TG中均表達(dá)上調(diào)，將SGK-1作為治療靶點(diǎn)，抑制患者異常表達(dá)的SGK-1，可能具有抗炎和緩解疼痛的雙相效應(yīng)。但SGK-1參與TMJ-OA進(jìn)程的分子機(jī)制及涉及的信號(hào)通路調(diào)控途徑尚不清楚，還需進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞水平深入研究。