韓玉立，董夏男，楊 柳，李學(xué)望，李 艷，李衛(wèi)平，李維祖

衰老是眾多疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)因素。腎臟是最易受到衰老影響的器官之一，而腎臟纖維化是腎臟衰老的結(jié)構(gòu)變化之一[1]。在腎臟衰老的眾多機(jī)制中，氧化應(yīng)激和炎癥備受關(guān)注。氧化應(yīng)激是由于內(nèi)源性活性氧(reactive oxygen species, ROS)的過度生成對細(xì)胞造成損傷的過程。有報(bào)道[2]稱，ROS的長期積累在腎臟纖維化中起著關(guān)鍵作用。NADPH氧化酶(NADPH oxidases, NOX)是細(xì)胞中產(chǎn)生ROS的重要酶系統(tǒng)[3]。NOX家族由NOX1～5等同源物的細(xì)胞膜蛋白組成，其中在腎臟中主要表達(dá)的是NOX4[4]。炎癥也被認(rèn)為可能在衰老相關(guān)的腎臟損害中發(fā)揮重要作用。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白樣受體蛋白家族(nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein-like receptor protein, NLRP)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)形成炎癥小體的傳感器蛋白家族[5]。NLRP3炎癥小體可能是慢性腎臟疾病、急性腎損傷和糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制[6]。然而，NLRP3的激活是否參與衰老相關(guān)的腎臟纖維化仍不清楚。本研究旨在探索NOX4-NLRP3信號通路的激活在衰老小鼠腎臟纖維化中的作用，對研究腎臟與年齡相關(guān)因素的關(guān)系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物6月齡雄性、體質(zhì)量(33～40)g昆明種小鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，SCXK(皖)2017-001。48只小鼠依據(jù)體質(zhì)量被隨機(jī)化分為6、16、20和24月齡組(n=12)。小鼠飼養(yǎng)于溫度25 ℃，12 h/12 h明暗交替的環(huán)境中，小鼠可以自由進(jìn)食飲水，各組小鼠飼養(yǎng)條件保持一致。6、16、20和24月齡組的小鼠分別飼養(yǎng)6、16、20和24個(gè)月后處死取材。其中20月齡組的1例小鼠死亡，24月齡組的2例小鼠死亡。

1.2 主要試劑血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium，DHE)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；Hoechst 33258(美國Sigma公司)；兔抗膠原蛋白Ⅳ(collagen Ⅳ, COL4)抗體、兔抗NLRP3多克隆抗體、兔抗NOX4多克隆抗體、兔抗p47phox多克隆抗體和兔抗p22phox多克隆抗體(上海bioworld生物技術(shù)有限公司)；兔抗胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；兔抗Caspase-1多克隆抗體、兔抗白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)多克隆抗體和兔抗轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)多克隆抗體(美國abcam公司)；小鼠抗β-actin、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)和DAB染色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.3 主要方法

1.3.1BUN和SCr的測定 腹腔注射3%三溴乙醇將小鼠麻醉，并從心臟采集血樣，離心分離出血清。試劑盒檢測BUN和SCr的水平，以評估不同組別的腎功能。

1.3.2腎皮質(zhì)中ROS水平檢測 小鼠尾靜脈注射DHE工作液(100 μmol/L，0.1 ml/10g)，30 min后取出腎臟并嵌入OCT包埋劑。用冷凍切片機(jī)將腎臟切成10 μm的切片。然后用Hoechst 33258孵化切片5 min。使用熒光顯微鏡觀察切片。Image-Pro Plus 6.0對每個(gè)切片中腎皮質(zhì)的5個(gè)隨機(jī)區(qū)域(×400)的DHE染色的平均熒光密度進(jìn)行量化，以評估ROS的產(chǎn)生。

1.3.3測定衰老相關(guān)的β-Gal活性 冰凍切片使用試劑盒進(jìn)行β-Gal染色。用光學(xué)顯微鏡拍照，Image-Pro Plus 6.0對每個(gè)切片中腎皮質(zhì)的5個(gè)隨機(jī)區(qū)域(×400)的平均光密度進(jìn)行量化，以評估β-Gal活性。

1.3.4腎臟組織學(xué)評價(jià) 小鼠的腎臟浸泡在4%多聚甲醛24 h后取出在石蠟中包埋，切片，脫蠟。進(jìn)行蘇木精和伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，高碘酸-希夫(periodic acid-Schiff , PAS)染色和Masson染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，選取切片中的5個(gè)隨機(jī)區(qū)域(×400)的腎小球進(jìn)行定量分析。Image J檢測PAS染色中腎小球的面積和直徑。Image-Pro Plus 6.0對PAS和Masson染色進(jìn)行量化分析，用陽性區(qū)域的平均密度來評估腎臟組織學(xué)的變化。

1.3.5免疫組化 腎組織石蠟切片脫蠟，在3%的雙氧水中孵化10 min。將切片在微波爐中的檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中沸騰7 min，并用正常的山羊血清封閉30 min。將切片與COL4、NLRP3抗體在4 ℃下孵育過夜。洗凈切片，二抗孵育1 h，然后用DAB染色，在顯微鏡下觀察拍照。每張切片選5個(gè)腎臟皮質(zhì)區(qū)域(×400)進(jìn)行定量分析，Image-Pro Plus 6.0測量陽性區(qū)域的平均密度，以評估COL4和NLRP3的表達(dá)。

1.3.6Western blot實(shí)驗(yàn) 取腎皮質(zhì)組織50 mg用RIPA法提取總蛋白。等量的蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下封閉1 h，并在4 ℃下用以下抗體孵育過夜：NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、NOX4、p47phox、p22phox、TGF-β1和β-actin單克隆抗體(1 ∶1 000)。然后將PVDF膜與相應(yīng)的二抗在室溫下孵育1 h。用Chemi-Doc MP、Bio-Rad成像系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行拍照。Image J測量蛋白條帶的灰度值，并與相應(yīng)的β-actin進(jìn)行歸一化。

2 結(jié)果

2.1 衰老對小鼠SCr和BUN和腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響與6月齡小鼠相比，老年小鼠的SCr和BUN水平增加(P<0.05，P<0.01)，見圖1A、B。HE染色結(jié)果顯示，在20和24月齡小鼠中，腎小球和腎小管組織出現(xiàn)了損傷，許多腎小管上皮細(xì)胞空泡化、扁平和脫落，管腔腫脹、破裂和間質(zhì)炎癥浸潤。腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)增加，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，系膜面積比升高，見圖1C。

2.2 衰老對小鼠腎皮質(zhì)中β-半乳糖苷酶表達(dá)的影響β-Gal活性上調(diào)是衰老細(xì)胞的一個(gè)重要標(biāo)志。結(jié)果顯示，隨著小鼠年齡的增長，β-Gal活性增加(P<0.05或P<0.01),見圖1D、E。

圖1 衰老對血清中腎功能參數(shù)，腎臟病理形態(tài)(HE ×400)和β-Gal活性的影響

2.3 衰老對小鼠腎臟酸性糖蛋白沉積的影響PAS染色結(jié)果顯示，與6月齡小鼠相比，20和24月齡小鼠腎小管上皮細(xì)胞和基質(zhì)中沉積的酸性糖蛋白增加，腎小球酸性糖蛋白沉積的面積和水平增加，其紅色密度更高；進(jìn)一步測量腎小球的直徑，與6月齡小鼠相比，20和24月齡的小鼠的腎小球直徑也增加(P<0.05或P<0.01)，見圖2A～D。

圖2 衰老對小鼠腎小球和腎小管酸性糖蛋白沉積的影響 PAS染色 ×400

2.4 衰老對小鼠腎臟纖維化的影響Masson染色顯示，6月齡和16月齡小鼠的腎小球和間質(zhì)沒有明顯的腎臟纖維化。在20和24月齡小鼠中，腎小球和腎間質(zhì)纖維化增加(P<0.01)，見圖3A、B。在20和24月齡小鼠中，COL4在腎小球和腎小管中的表達(dá)增加(P<0.01)，見圖4A、B。16月齡小鼠TGF-β1在腎皮質(zhì)中的表達(dá)增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。20和24月齡小鼠TGF-β1在腎皮質(zhì)中的表達(dá)增加(P<0.01)，見圖4C。

圖3 衰老對6、16、20和24月齡小鼠的腎臟膠原蛋白沉積的影響(n=4)

圖4 衰老對6、16、20和24月齡小鼠腎皮質(zhì)中COL4和TGF-β1表達(dá)的影響(n=4)

2.5 衰老對小鼠腎皮質(zhì)中ROS產(chǎn)生的影響DHE熒光染色結(jié)果顯示，與6月齡小鼠相比，16、20和24月齡小鼠腎皮質(zhì)中的ROS產(chǎn)生增加(P<0.01)，見圖5A、B。

圖5 衰老對6、16、20和24月齡小鼠腎皮質(zhì)中ROS生成及NOX4、p22phox和p47phox表達(dá)的影響(n=3)

2.6 衰老對小鼠腎皮質(zhì)中NOX4、p22phox和p47phox表達(dá)的影響蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與6月齡組小鼠相比，20和24月齡小鼠腎皮質(zhì)中NOX4、p22phox和p47phox的表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01)，見圖5C～E。

2.7 衰老對小鼠腎皮質(zhì)中NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β表達(dá)的影響與6月齡小鼠相比，16、20和24月齡小鼠腎皮質(zhì)中NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01)，見圖6A～D。免疫組化法檢測NLRP3在腎皮質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果顯示，隨著年齡的增加，小鼠的腎小球中NLRP3的表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01)，見圖7A、B。

圖6 衰老對6、16、20和24月齡小鼠腎皮質(zhì)中NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β表達(dá)的影響(n=3)

圖7 衰老對6、16、20和24月齡小鼠腎皮質(zhì)中NLRP3表達(dá)的影響(n=4)

3 討論

該研究探索了衰老小鼠的腎臟纖維化的變化及與NOX4-NLRP3信號通路的相關(guān)性。該研究表明，20和24月齡小鼠BUN和SCr水平、腎皮質(zhì)β-Gal活性、ROS和IL-1β水平以及病理形態(tài)學(xué)和腎臟纖維化相關(guān)參數(shù)都增加(P<0.01)。與腎臟衰老的病理變化相一致，20和24月齡小鼠腎皮質(zhì)中NOX4和NLRP3炎癥小體的表達(dá)增加(P<0.05)。這些結(jié)果表明，NOX4介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活可能在衰老相關(guān)的腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用。

腎臟衰老是一個(gè)復(fù)雜的過程，其特點(diǎn)是腎臟功能逐漸退化和結(jié)構(gòu)逐漸改變[7]。在衰老過程中，受損的細(xì)胞器和線粒體有明顯的積累，將導(dǎo)致腎功能不全[8]。當(dāng)腎臟發(fā)生進(jìn)行性和破壞性損傷時(shí)，BUN和SCr的產(chǎn)生將增加[9]。該研究結(jié)果也同樣證實(shí)了這一點(diǎn)。此外，衰老的腎臟表現(xiàn)出交聯(lián)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和纖維化的增加。TGF-β1是腎臟疾病最重要的促纖維化因子[10]，其表達(dá)在20和24月齡小鼠增加。該研究數(shù)據(jù)表明，16月齡小鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能開始出現(xiàn)輕微的改變，纖維化不明顯，但是促纖維化因子開始增加。而20和24月齡小鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能都出現(xiàn)了改變，腎小管和腎小球出現(xiàn)纖維化。

各種機(jī)制參與了與衰老相關(guān)的腎臟老化損傷，如氧化應(yīng)激、炎癥、線粒體功能障礙和鈣調(diào)節(jié)的改變等。氧化應(yīng)激是細(xì)胞和組織中氧化和抗氧化之間的不平衡，是氧自由基和相關(guān)ROS過度生產(chǎn)的結(jié)果[11]。該研究中ROS的產(chǎn)生在20和24月齡小鼠中增加。NOX4是參與慢性腎臟疾病發(fā)展的ROS氧化應(yīng)激的主要來源[12-13]。與ROS相似，6月齡小鼠腎皮質(zhì)中NOX4、p22phox和p47phox的表達(dá)較低，而在20和24月齡小鼠中則增加。提示NOX4介導(dǎo)的ROS生成在衰老過程中對腎臟纖維化有重要作用。炎癥也在腎臟纖維化的發(fā)展中起著重要作用。由巨噬細(xì)胞移動抑制因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是糖尿病腎病中腎臟纖維化發(fā)展的重要原因[14]。NADPH氧化酶激活過度產(chǎn)生的ROS與NLRP3炎癥小體的成熟密切相關(guān)[15]。在衰老小鼠腎臟NLRP3炎癥小體的激活過程中，NOX4的激活起到關(guān)鍵的促進(jìn)作用。

總之，該研究發(fā)現(xiàn)20和24月齡小鼠腎皮質(zhì)ROS和IL-1β水平升高，并伴有衰老相關(guān)的腎損傷和纖維化。在衰老過程中，腎臟中的NOX4和NLRP3炎癥小體被激活，提示NOX4介導(dǎo)的過量ROS的產(chǎn)生在腎皮質(zhì)NLRP3炎癥小體的激活中起重要作用，與小鼠衰老相關(guān)的腎損傷和纖維化密切相關(guān)。但是NOX4和NLRP3炎癥小體參與衰老過程中腎臟纖維化的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。