楊 洋，錢中潤(rùn)，吳婧婧

膠質(zhì)瘤是成人最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤，其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)惡性程度最高，預(yù)后極差。盡管當(dāng)今醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展精進(jìn)，膠質(zhì)瘤的治療還是以手術(shù)聯(lián)合放化療為主，GBM患者的中位生存期仍只有14個(gè)月左右[1-3]。GBM中存在大量低分化的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells，GSCs)，被認(rèn)為是引起腫瘤耐藥性和腫瘤復(fù)發(fā)的“元兇”[1-5]。G蛋白偶聯(lián)受體激酶5(G protein coupled receptor kinase-5, GRK5)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，其功能涉及多種病理過(guò)程。前期研究[6]表明GRK5的表達(dá)分布與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞有關(guān)。Moesin屬于ERM蛋白家族(The Ezrin-Radixin-Moesin proteins)[7]，可通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白改變細(xì)胞遷移活性。Moesin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[7-8]。前列腺癌研究[9]中提示Moesin是GRK5的磷酸化底物。GRK5通過(guò)磷酸化位點(diǎn)T66結(jié)合Moesin，靶向調(diào)控Moesin亞細(xì)胞分布[9]。而GRK5-Moesin在膠質(zhì)瘤中的定位關(guān)系和分布特點(diǎn)尚不清楚。

該研究通過(guò)免疫組化和免疫熒光分析GRK5和Moesin在GBMs中的亞細(xì)胞定位和分布特點(diǎn)，以及GRK5-Moesin與腫瘤血管及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的位置關(guān)系，進(jìn)而研究上調(diào)/下調(diào)GRK5活性對(duì)Moesin的影響，以及對(duì)U87細(xì)胞生物學(xué)活性的改變。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；GRK5上調(diào)質(zhì)粒(GV358/GRK5)和GRK5敲減質(zhì)粒(GV248/shRNA)慢病毒液購(gòu)自上海GenePharma公司；RNeasy Mini Kit試劑盒購(gòu)購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司；AceQ SYBR Green Master Mix試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物技術(shù)股份有限公司；GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司、GRK5抗體購(gòu)自中國(guó)南京Bioworlde公司；Moesin抗體購(gòu)自美國(guó)Affbiotech公司；CD44抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；熒光二抗均購(gòu)自武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司；超敏ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fish公司；相關(guān)引物設(shè)計(jì)自美國(guó)Invitrogen公司。細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購(gòu)自日本東仁化學(xué)科技有限公司；Annexin V-PE/7AAD凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基公司；細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)使用的BioCoatTMInvasion Chambers小室和Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀、生物安全柜和細(xì)胞培養(yǎng)箱等均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；流式細(xì)胞儀來(lái)自美國(guó)Beckham公司；蛋白與核酸電泳設(shè)備購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。本研究中涉及的膠質(zhì)瘤樣本均取自中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科確診并手術(shù)的膠質(zhì)瘤患者。所有患者術(shù)前均未接受化療或放療。所有患者術(shù)前均獲得知情同意。所有研究方法和程序均經(jīng)中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2019-X(H)-029)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和病毒包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染 U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系來(lái)自腦功能與腦疾病安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。該細(xì)胞系經(jīng)中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)使用[6,10-11]。細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，置于37 ℃、5% CO2的濕化培養(yǎng)箱中。用GRK5上調(diào)質(zhì)粒(GV358/GRK5)和GRK5敲減質(zhì)粒(GV248/shRNA)慢病毒液感染細(xì)胞。根據(jù)說(shuō)明書(shū)加入1 μg/ml聚凝胺存和5 μg/ml嘌呤霉素(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)到培養(yǎng)基中，將感染細(xì)胞傳代至10%匯合。未處理的U87細(xì)胞定義為空白對(duì)照組；表達(dá)GV358/GRK5、GV248/shRNA、LV-3陰性對(duì)照的細(xì)胞分別定義為U87-UP、U87-KD、NC組。采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)和Western blot檢測(cè)GRK5的表達(dá)。

1.2.2RNA分離和qRT-PCR 利用Qiagen RNeasy Mini Kit從膠質(zhì)瘤細(xì)胞中提取總RNA。然后，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將2 mg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。所有的程序都是按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行的。采用AceQ SYBR Green Master Mix進(jìn)行qPCR檢測(cè)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)的倍數(shù)變化[6,11]。引物序列為：人GRK5，F(xiàn)：5′-AGGAGCT GAACGTGTTTGGA-3′, R：5′-TTGTTCTGATGCTGC CGCT-3′；人GAPDH，F(xiàn)：5′-TCGGAGTCAACGGAT TTGGT-3′, R：5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′。

1.2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[6,10]，GRK5(1 ∶500)和Moesin (1 ∶500)在4 ℃下過(guò)夜。使用抗GAPDH的抗體(1 ∶1 000)在室溫下1小時(shí)，使用ECL檢測(cè)系統(tǒng)通過(guò)化學(xué)發(fā)光觀察免疫反應(yīng)蛋白。采用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)定蛋白條帶強(qiáng)度。

1.2.4細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞在12孔板中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合到80-90%時(shí)，用標(biāo)準(zhǔn)的200 μl槍頭尖在12孔板的單層細(xì)胞上制造出劃痕。在24和48 h，觀察細(xì)胞向刮拭區(qū)遷移，在固定觀察點(diǎn)使用顯微鏡拍攝圖像。通過(guò)測(cè)量細(xì)胞進(jìn)入劃痕區(qū)域的運(yùn)動(dòng)來(lái)確定細(xì)胞遷移。使用Image J軟件進(jìn)行定量分析，結(jié)果以百分比表示:傷口閉合面積相對(duì)于最初傷口面積的平均值[6,10]。

1.2.5侵襲試驗(yàn) 采用BioCoatTMInvasion Chambers小室進(jìn)行。用基質(zhì)凝膠(Matrigel)包覆上室后將約 5 ×104個(gè)細(xì)胞用200 μl無(wú)血清DMEM重懸并加入上腔，在下室中加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM。37 ℃培養(yǎng)18 h后，去除膜上側(cè)細(xì)胞，用1%多聚甲醛固定膜下表面受侵細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色。然后，在200倍光學(xué)顯微鏡下，每個(gè)小室選取8個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，取平均數(shù)作為該小室的細(xì)胞計(jì)數(shù)[6,10]。

1.2.6細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用CCK-8(日本DOJINDO)檢測(cè)細(xì)胞增殖。將2×104的膠質(zhì)瘤細(xì)胞植入96孔培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)24、48、72、96 h后，用含1 ∶10稀釋CCK-8的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。在37 ℃下再孵育2 h后，用設(shè)置在450 nm處的分光光度計(jì)測(cè)量吸光度[6]。

1.2.7免疫熒光三重染色分析 針對(duì)膠質(zhì)瘤組織切片，首先進(jìn)行載玻片脫脂和抗原提取，將涂膠載玻片放入EDTA緩沖液(pH 8.0, 塞維爾生物技術(shù)有限公司，武漢)，加熱8 min。用含2.5%山羊血清和0.5% SDS的緩沖液在室溫下阻斷1 h。然后用兔抗人GRK5(1 ∶1 000)、小鼠抗人Moesin(1 ∶3 000)和小鼠抗人CD44(1 ∶2 000)抗體在0.01 M磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate-buffered saline，PBS)、0.5%牛血清白蛋白和0.05% NaN2中過(guò)夜。沖洗玻片，用相應(yīng)的二抗依次孵育：HRP標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗(1 ∶500)，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠熒光二抗(1 ∶500)，Cy5標(biāo)記山羊抗小鼠熒光二抗(1 ∶400)，50 min/次。DAPI染核，蓋玻片覆蓋后熒光顯微鏡下觀察。針對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行染色，首先將細(xì)胞重懸于含血清培養(yǎng)基，滴加到多聚賴氨酸包被蓋玻片上培養(yǎng)過(guò)夜。用40 g/ml多聚甲醛4 ℃固定30 min，0.2% TritonX-100通透10 min。山羊血清封閉30 min。再同時(shí)加上述抗體過(guò)夜，后續(xù)步驟同上。

1.2.8免疫組化及HE染色 石蠟包埋切片、脫蠟、水化，GRK5(1 ∶500)或Moesin(1 ∶500)或CD44(1 ∶500)作為一抗，嚴(yán)格按照試劑盒步驟操作。光鏡下觀察，染色結(jié)果判定：胞質(zhì)或胞膜染成棕黃色為陽(yáng)性。石蠟包埋的組織切片用10%多聚甲醛固定后行HE染色。

1.2.9細(xì)胞凋亡檢測(cè) 使用Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測(cè)試劑盒分析膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)用Annexin V-PE和活性染料7-氨基-放線菌素D(7-amino-actinomycin D，7AAD)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行染色。染色細(xì)胞立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 GRK5和Moesin在膠質(zhì)瘤中共表達(dá)情況及與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞關(guān)系通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞及高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中GRK5與Moesin的表達(dá)相關(guān)性。結(jié)果顯示GRK5主要以在細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)為主，在胞膜表達(dá)較少；Moesin在胞質(zhì)表達(dá)較弱，而在細(xì)胞膜中表達(dá)較多。GRK5與Moesin的共表達(dá)部位在圖中顯示為黃色區(qū)域(圖1、2)。CD44作為另一種膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，被發(fā)現(xiàn)在GBM細(xì)胞膜存在陽(yáng)性表達(dá)(呈粉色，見(jiàn)圖1、2)；且在部分GBM細(xì)胞中可觀察到GRK5、Moesin與CD44三者共同定位于細(xì)胞膜上同一位置的共表達(dá)，見(jiàn)圖1、2。而作為對(duì)照，正常腦組織中GRK5、Moesin和CD44的免疫組化和免疫熒光染色均為陰性。

圖1 GRK5、Moesin及CD44在GBMs中存在共定位

2.2 GRK5、Moesin與膠質(zhì)瘤“壁龕”樣結(jié)構(gòu)關(guān)系光鏡及熒光顯微鏡下觀察，GBM組織樣本中存在許多類似“壁龕”樣的結(jié)構(gòu)，CD44在此類結(jié)構(gòu)中富集表達(dá)。熒光顯微鏡下觀察，壁龕結(jié)構(gòu)中的腫瘤細(xì)胞內(nèi)大多同時(shí)表達(dá)GRK5和Moesin，且壁龕中部分細(xì)胞存在GRK5-Moesin-CD44三者的共定位，見(jiàn)圖2。

圖2 GRK5-Moesin-CD44在膠質(zhì)瘤細(xì)胞壁龕中富集

2.3 GRK5和Moesin在膠質(zhì)瘤血管的分布研究顯示，GBM樣本中的血管附近細(xì)胞存在大量GRK5和Moesin陽(yáng)性表達(dá)(圖3B、C)。另一方面，腫瘤中各個(gè)血管周圍GRK5陽(yáng)性和Moesin陽(yáng)性細(xì)胞的分布卻又存在明顯差異(圖3D～G)：圖3D中的血管結(jié)構(gòu)以Moesin陽(yáng)性表達(dá)為主，GRK5陽(yáng)性表達(dá)較少。圖3E中的GRK5陽(yáng)性細(xì)胞均勻分布于整個(gè)血管，Moesin陽(yáng)性細(xì)胞則局限于血管內(nèi)膜。圖3F中的血管結(jié)構(gòu)以GRK5陽(yáng)性細(xì)胞為主，Moesin陽(yáng)性細(xì)胞較少。圖3G中的血管則表現(xiàn)為GRK5和Moesin共同分布，部分細(xì)胞中存在亞細(xì)胞共定位。

圖3 GRK5與Moesin在膠質(zhì)瘤血管的表達(dá)和分布

2.4 建立GRK5上調(diào)/下調(diào)的U87穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系利用GRK5上調(diào)/敲減質(zhì)粒的慢病毒液對(duì)U87細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系(空白對(duì)照組：U87；陰性對(duì)照組：U87-NC；GRK5上調(diào)組：U87-UP；GRK5下調(diào)組：U87-KD)。鑒定結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，U87-UP組的GRK5的mRNA(F=75.823，P<0.01)和蛋白水平均提高(F=99.707，P<0.01)，而U87-KD組的GRK5的mRNA(F=27.780，P=0.002)和蛋白水平(F=9.900，P<0.05)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。

圖4 GRK5上調(diào)/下調(diào)可靶向調(diào)控Moesin表達(dá)

2.5 GRK5-Moesin表達(dá)改變對(duì)U87生物學(xué)活性的影響利用GRK5上調(diào)/下調(diào)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，分析GRK5活性改變對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第48、72、96 h，GRK5-UP組細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組及GRK5-KD組增強(qiáng)，而GRK5-KD組細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組及GRK5-KD組減弱，見(jiàn)圖4D。如圖5A、B所示，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，GRK5上調(diào)可提高U87細(xì)胞遷移能力，促進(jìn)“劃痕”愈合(P<0.01，F(xiàn)=110.163)，而GRK5下調(diào)的U87細(xì)胞“劃痕”愈合明顯減慢(P<0.01，F(xiàn)=109.606)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5C、D，U87-UP組細(xì)胞的侵襲能力較對(duì)照組提高(P<0.01，F(xiàn)=84.961)，而U87-KD則降低(P<0.01，F(xiàn)=86.755)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，U87-UP組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡較U87-NC及U87組相對(duì)減少(P<0.05，F(xiàn)=11.244)，而U87-KD組細(xì)胞凋亡比U87-NC及U87組增加(P<0.01，F(xiàn)=87.464)，見(jiàn)圖5E、F。

圖5 GRK5對(duì)U87細(xì)胞生物學(xué)活性的影響

3 討論

盡管GRK5在心血管疾病發(fā)病機(jī)制中的作用已經(jīng)被廣泛研究，但直到近年來(lái)，它在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用才逐漸被揭示。GRK5被認(rèn)為在調(diào)節(jié)肺癌、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)中發(fā)揮作用，而在膠質(zhì)瘤中的研究還相對(duì)較少。近期的研究[9]表明GRK5通過(guò)結(jié)合T66位點(diǎn)使Moesin磷酸化，從而對(duì)前列腺癌細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的重塑、侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。而在GBM細(xì)胞中，Moesin是被磷酸化激活的主要ERM成員，在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平上調(diào)，并且與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞密切相關(guān)[12]。

本研究表明GRK5和Moesin均在GBM中高表達(dá)，課題組不僅觀察到GRK5、Moesin和CD44三者在GBM細(xì)胞膜上存在共表達(dá)，而且在腫瘤血管和膠質(zhì)瘤壁龕結(jié)構(gòu)大量富集分布，提示GRK5和Moesin可能參與構(gòu)成膠質(zhì)瘤的壁龕結(jié)構(gòu)。GRK5-Moesin可能是GBMs維系膠質(zhì)瘤干細(xì)胞“干性”的重要調(diào)節(jié)子。而調(diào)控GRK5可顯著改變Moesin表達(dá)，進(jìn)一步提示GRK5-Moesin在膠質(zhì)瘤中存在相互作用，GRK5作為上游基因，可靶向調(diào)控Moesin的表達(dá)活性。

GRK5+細(xì)胞和Moesin+細(xì)胞在膠質(zhì)瘤各個(gè)血管周圍富集，但呈現(xiàn)出差異化分布特點(diǎn)。近年來(lái)有報(bào)道[13]提出，GBM生長(zhǎng)需要不同的微循環(huán)模式，尤其是GBM細(xì)胞來(lái)源的血管(GBM cell-derived vessels，GDVs)。分析膠質(zhì)瘤患者術(shù)后病理樣本發(fā)現(xiàn)，樣本中GDVs較多的患者的中位生存期僅為9.56個(gè)月，而GDVs較少的患者的中位生存期為13.60個(gè)月。那么，GRK5-Moesin與膠質(zhì)瘤血管類型存在怎樣的關(guān)系，GRK5-Moesin差異化分布與膠質(zhì)瘤內(nèi)血管類型的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

GRK5活性改變可影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)活性。GRK5上調(diào)可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；GRK5上調(diào)/下調(diào)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率隨之減少/增加。目前已研制出針對(duì)GRK5的特異性靶向藥物：舒尼替尼(Sunitinib)是已被FDA批準(zhǔn)的針對(duì)GRK5最有效的小分子抑制劑[14]，主要抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體，從而阻斷腫瘤的血管生成[15]。舒尼替尼能否通過(guò)靶向抑制GRK5使膠質(zhì)瘤患者獲益還需繼續(xù)深入研究。