鄭立友，莫妮娜，胡秀秀，賈惠婷，王 政，謝亮亮，謝 丹，金 俊，金青哲，郭紅艷

(1.安徽工程大學 生物與食品工程學院，安徽 蕪湖214000； 2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122)

植物油脂富含生育酚，但不同種類的植物油脂所含生育酚的類型和含量大不相同[1]。生育酚醌(TQ)是生育酚的主要脂質(zhì)過氧化代謝物，其在生物系統(tǒng)中具有抗菌活性[2]、抗氧化活性[3]、選擇性細胞毒性[4-7]等多種作用，近年來逐漸受到關(guān)注，其有4種主要結(jié)構(gòu)：α-TQ、β-TQ、γ-TQ、δ-TQ(見圖1)。

圖1 生育酚醌(TQ)的主要結(jié)構(gòu)

TQ是一類潛在的食品安全危害因子。研究表明，因α-TQ中六元環(huán)被完全取代，不具有芳基化活性，而β-TQ、γ-TQ、δ-TQ由于六元環(huán)未被完全取代，具有芳基化活性，因而具有一定的細胞毒性[8-9]。相較于生育酚研究的深度及廣度，TQ的研究起步較晚，相關(guān)研究亟待開展。目前植物油脂經(jīng)常用于加熱使用(微波、烘箱和煎炸等過程)，勢必會有TQ的生成。因此，本文歸納總結(jié)了TQ的檢測、食品加工中TQ的生成規(guī)律影響因素及其毒性和抗氧化等方面的研究現(xiàn)狀，進而指出了現(xiàn)階段研究存在的問題，并提出了TQ研究的發(fā)展方向，旨在為充分研究TQ提供一定的研究基礎(chǔ)參考，避免丙烯酰胺、氯丙醇酯等類似食品安全事件的再次發(fā)生。

1 生育酚醌的檢測方法

1.1 液相色譜法

因液相色譜無需進行樣品衍生化處理，樣品預處理相對簡單，因此其被廣泛應(yīng)用于生育酚及其醌類物質(zhì)的檢測。目前主要采用甲醇/乙腈-水為主要流動相的反相液相色譜系統(tǒng)進行生育酚及其醌類化合物的檢測分析，如：Kruk等[10]通過反相高效液相色譜系統(tǒng)RP-HPLC，配備熒光檢測器，發(fā)射波長290 nm，吸收波長330 nm)，配合鋅柱柱后衍生技術(shù)測定衣藻提取物中的α-TQ和γ-TQ的含量，發(fā)現(xiàn)兩者含量受植物生長環(huán)境及生長階段的影響較大；Kreps等[11]采用正相色譜同步測定生育酚單體(α-、β-、γ-、δ-生育酚)和總醌的含量，同時采用RP-HPLC梯度洗脫條件下測定γ-TQ。

目前，高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用作為物質(zhì)高效分離檢測手段，已開始用于測定生育酚及其氧化產(chǎn)物TQ等[12-13]。前期本文作者通過超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)分別檢測并鑒定了生育酚及TQ等物質(zhì)[14]，后續(xù)將進一步優(yōu)化色譜條件，建立同步檢測的方法。

目前液相色譜配備紫外檢測器(HPLC-UV)應(yīng)用最為廣泛，隨著檢測手段及檢測技術(shù)的升級，液質(zhì)聯(lián)用法將更為普及。本文主要列舉了部分有關(guān)TQ和生育酚的液相色譜測定方法，具體參數(shù)如表1所示。

表1 HPLC測定TQ的分析檢測方法

續(xù)表1

1.2 其他方法

薄層色譜法也被用于TQ的分離檢測[25]。另外，也有學者采用氣質(zhì)聯(lián)用檢測TQ，如Melchert等[26]采用羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20) 進行樣品預處理、預分離，并采用GC-MS進行TQ(游離型和硅烷化型)含量的測定，在全掃描模式下，檢測限和定量限分別為1 μL進樣體積含有1 ng和10 ng物質(zhì)，達到了較好的定量定性效果。

2 食品中生育酚醌生成規(guī)律影響因素

TQ主要在富含生育酚的植物油脂加熱過程中形成，其中150～220℃為其生成的最佳溫度；加工溫度較低，TQ的含量較低。因植物油脂中生育酚單體含量差異較大，熱加工過程中產(chǎn)生的TQ構(gòu)成(種類及含量)也有較大的差異。

首先，溫度是影響TQ生成的主要因素。Murkovic等[27]通過加熱強化α-生育酚的玉米油時發(fā)現(xiàn):90℃下α-TQ含量隨加熱時間的延長(0～11 h)逐步增加，在11 h時α-TQ含量高達130 mg/kg；180℃下加熱7 h，α-TQ含量高達275 mg/kg，而后含量趨于穩(wěn)定；220℃下α-TQ生成速率最快，加熱1 h其含量已達到150 mg/kg，但由于該溫度下α-TQ不穩(wěn)定，隨著加熱時間的延長，其含量呈逐步下降的趨勢，這也與文獻[23]報道的結(jié)果相一致。Verleyen等[21]研究表明，脂質(zhì)模擬體系中α-生育酚在高溫煎炸(150～250℃)下發(fā)生熱氧化反應(yīng)生成α-TQ。一般情況下，同一溫度下，隨著加熱時間(一定范圍內(nèi))的延長，TQ的含量逐漸升高，但溫度過高會導致TQ含量降低?？梢?，不同溫度下，α-TQ生成規(guī)律不一。

其次，油脂基質(zhì)中生育酚的初始含量也是影響TQ生成的因素之一。Rennick等[22]通過180℃加熱葵花籽油和大豆油發(fā)現(xiàn):未添加α-生育酚情況下，加熱葵花籽油5 h和10 h，α-TQ含量分別增加至87 mg/kg和104 mg/kg，加熱大豆油5 h和10 h，α-TQ含量分別增加至29 mg/kg和53 mg/kg；添加α-生育酚的情況下，加熱葵花籽油5 h和10 h，α-TQ含量分別增加至127 mg/kg和164 mg/kg，加熱大豆油5 h和10 h，α-TQ含量分別增加至159 mg/kg和187 mg/kg?？梢?，基底中生育酚含量越高，隨著生育酚的消耗，一定條件下TQ的生成量也就越多。

再次，氧化條件也對TQ的生成有較大影響。Kreps等[25]通過Rancimat加速氧化葵花籽油(180℃)發(fā)現(xiàn):通空氣加熱2 h后α-TQ的含量達到最大值150 mg/kg，但同時在加熱過程中因α-TQ不穩(wěn)定發(fā)生降解，加熱2～10 h其含量呈下降趨勢；而不通空氣情況下，α-TQ含量在整個加熱過程中呈逐漸增加的趨勢。可見，加速氧化會加速TQ的生成。

最后，加熱方式也顯著影響TQ的生成規(guī)律。Kreps等[11]研究了微波加熱對TQ生成的影響，發(fā)現(xiàn)微波可加速TQ的生成，微波加熱菜籽油10 min即可生成 8 mg/kg的γ-TQ。另外，其研究了煎炸方式(淺表煎炸、深度煎炸)對煎炸油中TQ生成規(guī)律的影響，發(fā)現(xiàn)淺表煎炸產(chǎn)生的TQ顯著高于深度煎炸產(chǎn)生的量。同時,對γ-TQ的空間分布情況研究發(fā)現(xiàn)，淺表煎炸50 min內(nèi)，菜籽油生成了22 mg/kg 的γ-TQ，其中5～7 mg/kg的γ-TQ轉(zhuǎn)移至煎炸食品薯條中，而深度煎炸50 min，菜籽油中僅產(chǎn)生了6 mg/kg的γ-TQ。

3 生育酚醌的毒性

TQ具有一定的毒性，但具有兩面性。Lindsey等[28]發(fā)現(xiàn)在生物體系內(nèi)(平滑肌細胞增殖培養(yǎng)過程)脂質(zhì)過氧化中γ-TQ 具有高細胞毒性(細胞鋪滿培養(yǎng)階段，10～25 μmol/L；細胞增殖階段，1～10 μmol/L)，實驗中觀察到可引起細胞的凋亡。在此研究結(jié)果基礎(chǔ)上，Thornton等[4]進一步研究發(fā)現(xiàn)，γ-TQ、δ-TQ均呈現(xiàn)一定的細胞(平滑肌細胞)毒性，誘發(fā)細胞有絲分裂，并呈劑量依賴性，且γ-TQ毒性更強。與此同時，γ-TQ對藥物敏感的急性淋巴細胞白血病細胞系(CEM)和多重耐藥淋巴細胞白血病細胞系(CEM/VLB100)也具有高細胞毒性，并推測γ-TQ毒性可能源于Michael加合物生成。Cornwell等[29]研究發(fā)現(xiàn)，α-TQ無細胞毒性，而γ-TQ、δ-TQ在CEM 和CEM/VLB100均具有高細胞毒性(LD50<10 μmol/L)，且γ-TQ、δ-TQ相較于阿霉素(一種抗腫瘤藥物)具有更高的細胞毒性，同樣對CEM細胞具有選擇性細胞毒性。γ-TQ、δ-TQ屬于親核烷基化試劑，可生成Michael加合物和醌甲基類似物，烷基化反應(yīng)是親核醌類物質(zhì)致毒性的原因所在。Jones等[30]研究發(fā)現(xiàn)，γ-TQ對損傷細胞膜、活細胞數(shù)量的減少和凋亡激活等表現(xiàn)出濃度和時間依賴性的影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)，γ-TQ引起WiDr結(jié)腸腺癌細胞、HL-60白血病細胞和小鼠胸腺瘤細胞的凋亡主要源于其調(diào)控了參與凋亡級聯(lián)反應(yīng)的不同蛋白的表達，如細胞色素C的釋放和凋亡Caspase復合體形成[31-32]。由于γ-TQ、δ-TQ屬于芳基化醌類化合物，Wang 等[33]研究進一步指出芳基化醌類毒性機制主要源于Michael加合物生成和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，而非僅僅源于Michael加合物生成。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)TQ顯著抑制雄激素反應(yīng)性前列腺癌細胞增殖、雄激素受體活性和雄激素受體蛋白表達[34]。

因TQ對人急性淋巴母細胞白血病和早幼粒細胞白血病細胞具有強大的細胞毒性作用和誘導凋亡、逃脫耐藥性的特點，在醫(yī)學腫瘤的治療方面賦予了其作為強效化療劑的潛力[32]，這也與醌類物質(zhì)具有一定的抗癌、抗腫瘤活性相一致。

4 生育酚醌的抗氧化活性

近年來，隨著對醌類物質(zhì)認識和研究的深入，不少學者對醌類物質(zhì)的抗氧化活性也進行了相關(guān)研究[35-37]?，F(xiàn)階段關(guān)于TQ的抗氧化活性有體內(nèi)和體外研究，主要集中于體外研究。Bindoli等[38]研究發(fā)現(xiàn)，α-TQ可抑制脂質(zhì)體中抗壞血酸/Fe2+誘導的脂質(zhì)過氧化。Lindsey等[28]研究發(fā)現(xiàn)：在非生物模擬體系中，α-TQ的抗氧化活性與α-生育酚、γ-生育酚的抗氧化活性差異不顯著，而γ-TQ則在低濃度(1～100 μmol/L)下表現(xiàn)出抗氧化活性，而在高濃度(1 000 μmol/L)則表現(xiàn)出促氧化作用；在生物體系內(nèi)(平滑肌細胞增殖培養(yǎng)過程)脂質(zhì)過氧化中，α-TQ、α-生育酚、γ-生育酚的抗氧化活性也無顯著差異。Thornton等[4]進一步研究發(fā)現(xiàn)，模擬體系中α-TQ、γ-TQ、δ-TQ均在低濃度(1～10 μmol/L)下表現(xiàn)出抗氧化活性，而在高濃度(10～1 000 μmol/L)則表現(xiàn)出促氧化作用，且同樣濃度下γ-TQ的促氧化作用強于α-TQ、δ-TQ。與此同時，在平滑肌細胞培養(yǎng)過程中低濃度(1～50 μmol/L)的α-TQ、γ-TQ、δ-TQ均為抗氧化劑。Siegel等[39]研究發(fā)現(xiàn)，醌氧化還原酶可在細胞中將α-TQ還原成氫醌(TQH2)，進一步研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)α-TQ是一種有效的抗氧化劑，主要源于其可阻礙輔酶Q的電子轉(zhuǎn)移，此外，α-TQ也可被微粒體及線粒體中的酶還原生成TQH2，其抗氧化效果進一步增強[40]。

為更為全面客觀地評價TQ的抗氧化活性，學者對TQ的體內(nèi)抗氧化模型進行了研究。研究表明，α-TQ具有阿爾茨海默病(AD)的治療前景[41-42]。AD的病理變化與可溶性β-淀粉樣蛋白(Aβ)寡聚體、神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)。Yang[5]、Wang[43]等在前期體外研究發(fā)現(xiàn)α-TQ能夠抑制Aβ的聚集，減少Aβ誘導的細胞毒性的基礎(chǔ)上，進一步研究了α-TQ的體內(nèi)作用，發(fā)現(xiàn)α-TQ可使可溶性Aβ寡聚體的水平明顯降低，抑制NF-κB信號通路活化，減少AD小鼠的炎癥病理反應(yīng)，降低AD小鼠的氧化應(yīng)激水平，進而可有效阻遏阿爾茨海默病的產(chǎn)生與惡化。可見，TQ也具有一定的體內(nèi)抗氧化活性，值得進一步挖掘開發(fā)。

5 結(jié) 語

近年來，人們對生育酚的檢測及性質(zhì)做了廣泛的研究，但國內(nèi)對于TQ的研究尚未開展系統(tǒng)性報道。TQ是一類潛在的食品安全危害因子，但其又有一定的抗癌、抗氧化活性。有關(guān)TQ相關(guān)研究尚存在以下問題：①目前各TQ單體的定量檢測存在一定的困難，主要源于標準品的缺失。雖然有市售的α-TQ，但其他單體物質(zhì)仍需要實驗者自行合成再去定量，缺乏標準物質(zhì)，也就缺乏了物質(zhì)定量的準確性和統(tǒng)一性。因此，各TQ單體的制備需要進一步規(guī)范化。②因油脂加工方法和油脂烹調(diào)方式多樣，生育酚向TQ轉(zhuǎn)化的規(guī)律需進一步系統(tǒng)研究，包括油脂脫臭階段高溫下TQ的生成情況，煎炸油煎炸不同種類食品(薯條、雞塊等)時，TQ的生成、遷移及空間分布情況等，以及抑制TQ在植物油脂中的生成量及向食品遷移量的方法。③各TQ單體的毒性等研究需進一步擴展，如采用體內(nèi)實驗(如秀麗線蟲模型或斑馬魚模型等)更為全面地研究TQ的毒性及其致毒的分子機制。

針對以上存在的問題，關(guān)于TQ的后續(xù)研究應(yīng)主要集中于以下幾個方面：①注重TQ標準品的合成，建立標準物質(zhì)，便于檢測方法的建立。注重檢測方法的實用與便利，積極探索建立TQ的檢測方法，以便科學定量食品中TQ含量。②系統(tǒng)研究TQ在特定食品加工過程中的含量變化，為科學控制TQ在食品加工及烹調(diào)過程中的生成及遷移奠定一定的理論基礎(chǔ)。③TQ的毒性需要進一步研究，如對于正常細胞的致毒性需要研究論證,作為潛在的食品健康危害因子，需進一步通過體外、體內(nèi)實驗佐證其毒性及其致毒分子機制。