孟亞軍，李江濤，張 靜

(1. 中國人民解放軍陸軍第八十二集團軍醫(yī)院，河北 保定 071000；2. 河北省第八人民醫(yī)院，河北 石家莊 050000；3. 保定市第二中心醫(yī)院，河北 保定 072750)

前列腺癌是前列腺上皮細胞惡性增生所致的一種腫瘤，其發(fā)病率存在明顯的地域差異,歐美地區(qū)較高[1]。我國由于人口老齡化和生活方式的西方化,近年來其發(fā)病率出現(xiàn)升高趨勢,成為了威脅我國老年男性健康的重要疾病之一。前列腺癌中98%為腺癌,常從前列腺萎縮的外周部分發(fā)生,大多數(shù)為多病灶[2]。根治性前列腺切除術是治療局限于前列腺內腫瘤的主要術式,也可作為放療后復發(fā)患者的一種補救治療措施[3]。內分泌治療是前列腺治療的重要手段之一,但是絕大多數(shù)最初對內分泌治療敏感的患者在18～24個月后轉變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔4]，而目前對去勢抵抗性前列腺癌尚無有效治療策略。異黏蛋白(MTDH)是一種轉移黏附基因,是多種惡性腫瘤、炎性疾病的調節(jié)因子[5]，但其對化療藥物敏感性是否有影響尚不明確。本研究旨在通過觀察MTDH基因轉染前列腺癌PC-3細胞前后細胞中MTDH的表達情況及轉染后對化療藥物的敏感性,探討MTDH與藥物敏感性之間的關系,從而尋找一種可以評估前列腺癌預后并指導治療的分子生物學指標。

1 實驗材料與方法

1.1細胞株、藥物、試劑和儀器 前列腺癌PC-3細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；多西他賽(DTX)購自美國Selleck；1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青鏈霉素、鏈霉素購自美國Invitrogen公司；MTDH鼠抗人單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；反轉錄試劑盒購自賽默飛世爾科技公司；PCR儀購自美國ABI公司；Epics-XLⅡ型流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司；HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱購自哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)及轉染方法

1.2.1細胞株培養(yǎng)和耐藥株構建 參考文獻[6]方法，將前列腺癌PC-3細胞株置于10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的RPMI-1640的培養(yǎng)基中復蘇,放于37 ℃、5%的CO2中培養(yǎng),當細胞融合80%以上時,吸取培養(yǎng)瓶中的殘液,加入RPMI-1640終止。采用吸管將貼壁細胞吹打成細胞懸液,置于37 ℃、5%的CO2中繼續(xù)培養(yǎng)。采用濃度遞增的DTX(0.1 nmol/L、0.2 nmol/L、0.5 nmol/L、1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L)間斷性刺激PC-3細胞,當PC-3細胞株在當前濃度下恢復到未加藥的生長速度,且可以穩(wěn)定傳代,即可認為PC-3耐DTX細胞株(PC/DTX)構建成功。

1.2.2PC-3/DTX細胞分組和轉染 實驗分為對照組、NC-shRNA組和MTDH-shRNA組,每組取PC-3/DTX細胞以1×105個/孔密度接種至6孔細胞培養(yǎng)板中,對照組添加轉染試劑,NC-shRNA組轉染空載體shRNA-NC慢病毒,MTDH-shRNA組轉染MTDH-shRNA,按照Lipofectamine 3000試劑說明進行轉染,轉染48 h。

1.3檢測指標及方法

1.3.1MTDH mRNA檢測 采用qRT-PCR法檢測PC-3細胞和PC-3/DTX細胞中及PC-3/DTX細胞各組中MTDH mRNA表達情況：Tirzol法提取細胞中的RNA,反轉錄合成cDNA,采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒檢測。熒光定量PCR反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL,Reverse Primer C引物1 μL,Forward Primer引物1 μL；熒光定量PCR反應條件:95 ℃預變性60 s,1個循環(huán)；95 ℃變性10 s,60 ℃退火和延伸30 s,40個循環(huán)；用相對定量2-ΔΔCT方法計算MTDH mRNA表達量。

1.3.2MTDH和PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白檢測 采用Western blot法檢測：收集細胞,加入總蛋白提取液,充分吹打后放置冰上20 min,吸出勻漿液移入離心管中,9 000×g離心10 min,收集上清液,BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAG電泳,轉膜至PVDF膜,將膜置于脫脂奶粉中封閉,孵育60 min,棄封閉液,加入MTDH(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、mTOR(1∶200)、PI3K110α(1∶1 000)、p-Akt(1∶500)、p-mTOR(1∶200)和p-P70s6k(1∶500)一抗溶液,孵育60 min,加入二抗溶液(稀釋比例均為1∶10 000),孵育1 h,將β-actin作為內參,化學發(fā)光和顯影、定影,Quantityone軟件分析條帶光密度值。

1.3.3細胞存活率檢測 采用MTT 法檢測：將對照組、NC-shRNA組和MTDH-shRNA組PC-3/DTX細胞密度調整為1.0×105/mL,每個孔以200 μL接種于96孔的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后,分別加入不同濃度的DTX(20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L、160 nmol/L),對照組不加任何藥物,設置4個復孔,然后加入5 mg/mL的MTT工作液,混勻后放于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,離心后,去上清,每個孔中加入200 μL的二甲基亞砜,采用Bio-rad酶標儀檢測吸光度值。

1.3.4細胞凋亡檢測 細胞轉染后48 h,采用0.25%的胰酶和2%的EDTA消化,用50 μL的PBS重懸細胞,離心10 min,將細胞懸液轉移到試管中,分別加入5 μL的Annexin Ⅴ和10 μL的PI孵育15 min,上流式細胞儀檢測,采用Cellquest 1.2軟件分析。

2 結 果

2.1PC-3和PC-3/DTX細胞株中MTDH mRNA及蛋白表達情況 PC-3/DTX細胞株中MTDH mRNA及蛋白相對表達量分別為1.36±0.29和1.42±0.32，PC-3細胞中分別為0.48±0.11和0.56±0.13，PC-3/DTX細胞株中MTDH mRNA及蛋白相對表達量較PC-3細胞中高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.2各組PC-3/DTX細胞中MTDH mRNA及蛋白表達情況 對照組和NC-shRNA組MTDH mRNA及蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05),MTDH-shRNA組MTDH mRNA及蛋白相對表達量均明顯低于對照組和NC-shRNA組(P均<0.05)。見圖1和表1。

圖1 各組PC-3耐多西他賽細胞中MTDH蛋白表達情況

表1 各組PC-3耐多西他賽細胞中MTDH mRNA及蛋白表達情況

2.3各組PC-3/DTX細胞存活情況 不同濃度的DTX作用24 h后,對照組和NC-shRNA組細胞存活率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05),MTDH-shRNA組細胞存活率均明顯低于對照組和NC-shRNA組(P均<0.05)。見表2。

表2 不同濃度的多西他賽作用24 h后各組PC-3耐多西他賽細胞存活率比較

2.4各組PC-3/DTX細胞凋亡情況 對照組、NC-shRNA組、MTDH-shRNA組細胞凋亡率分別為(5.87±1.69)%、(6.03±1.74)%、(33.52±8.46)%，對照組和NC-shRNA組細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),MTDH-shRNA組細胞凋亡率明顯高于對照組和NC-shRNA組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 各組PC-3耐多西他賽細胞凋亡情況

2.5各組PC-3/DTX細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關因子蛋白表達情況 對照組和NC-shRNA組PC-3/DTX細胞中PI3K110α、p-Akt、p-mTOR和p-P70s6k蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05),MTDH-shRNA組PC-3/DTX細胞中PI3K110α、p-Akt、p-mTOR和p-P70s6k蛋白相對表達量均明顯低于對照組和NC-shRNA組(P均<0.05)，3組Akt和mTOR蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表3和圖3。

圖3 各組PC-3耐多西他賽細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關因子蛋白表達情況

表3 各組PC-3耐多西他賽細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關因子蛋白相對表達量比較

3 討 論

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率與年齡有關，70～80歲人群高發(fā)[7]。目前前列腺癌缺乏有效治療手段,DEX是化療主要用藥，初次用藥有效，但患者多在6.3個月左右出現(xiàn)腫瘤耐藥,導致治療失敗[8]。腫瘤耐藥是指長期使用某種藥物過程中,腫瘤細胞對于藥物作用產生耐受性,導致藥物作用顯著降低甚至無效[9-10]。在沒有新的替代藥物出現(xiàn)的情況下，如何逆轉DEX的耐藥,增強DEX化療方案的敏感性成為研究重點。近年來,采用RNA干擾技術,通過基因沉默的方式逆轉腫瘤耐藥研究取得了一定的成果,故本研究進行了相關探討。

MTDH基因又稱為AEG-1基因,由582個氨基酸組成,分子量64 kDa，起初在艾滋病病毒(HIV)包膜蛋白、腫瘤壞死因子或HIV-1感染處理過的原代培養(yǎng)的人胚胎星形膠質細胞中發(fā)現(xiàn)，隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中均有表達[11-12]。MTDH是一類多功能細胞增殖調控因子,在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有促腫瘤細胞生長、增殖、遷移、血管生成和抑制其凋亡等作用[13]。MTDH在前列腺癌細胞的生長調控和向惡性表型轉化方面起重要作用，阻斷MTDH的信號傳導會恢復細胞的表型，促進細胞凋亡，提高細胞對化療的敏感性,并抑制癌細胞轉移[14]。張玲芳等[15]研究表明,MTDH過表達引起的P-gp過表達和Wnt/β-catenin信號通路活化,可能與乳腺癌化療耐藥有關。侯贊等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-506-3p可通過靶向抑制MTDH的表達增強人前列腺癌耐藥細胞株PC-3/PTX的化學敏感性。

本實驗結果顯示,PC-3/DTX細胞株中MTDH mRNA及蛋白表達量明顯增高；沉默MTDH后，PC-3/DTX細胞株中MTDH mRNA及蛋白表達量和PC-3/DTX細胞存活率明顯降低,細胞凋亡率明顯增高,PI3K110α、p-Akt、p-mTOR和p-P70s6k蛋白表達量明顯降低。提示PC-3/DTX細胞株中MTDH高表達,MTDH可能通過PI3K/Akt/mTOR信號通路促進細胞增殖和抑制細胞凋亡,沉默PC-3/DTX細胞株MTDH基因后,可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,從而抑制PC-3/DTX細胞增殖,誘導其凋亡,并提高耐藥細胞對DTX的敏感性，將MTDH作為分子靶向的靶點在前列腺癌的治療領域有著廣闊的前景。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。