丁偉逸 張霆 林越 嚴(yán)寅杰

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)骨傷科 上海 200032）

隨著社會現(xiàn)代化的發(fā)展，高能量骨折損傷的發(fā)生率日益增多，有5%～10%的患者骨折后因損傷嚴(yán)重或感染等局部因素，或因吸煙、飲酒、代謝性疾病、手術(shù)方式等因素而導(dǎo)致骨延遲愈合，甚至不愈合[1～3]，使患者失去勞動力的同時，對其心理、生理帶來極大負(fù)擔(dān)[4]。

骨延遲愈合屬于中醫(yī)學(xué)“腎虛骨萎”范疇，是肢體損傷后，機(jī)體臟腑失和，氣血不足，脾胃虛弱，從而使得機(jī)體對水谷精微的吸收產(chǎn)生影響，腎氣虧虛造成骨折愈合延遲[5]。該病病機(jī)與肝脾腎三臟的虧虛以及腎精的不足有著密切的相關(guān)性。肝在體為筋，脾主運化，腎主藏精，主骨、生髓，腎中精氣的盛衰強(qiáng)弱，會直接影響骨骼的生長、營養(yǎng)、功能、愈合等各個方面。骨折長期不愈合，會導(dǎo)致身體元氣漸耗，腎中精氣虧虛，氣的生成不足，氣機(jī)升降失常，從而導(dǎo)致病位血運代謝失常，使得局部氣血紊亂，血不得行而致瘀，同時血瘀反過來會進(jìn)一步影響氣的生成與運行，因此“氣虛、血瘀、腎虧”是骨延遲愈合的基本病理基礎(chǔ)。上海中醫(yī)藥大學(xué)終身教授施杞先生根據(jù)多年治療骨延遲愈合的臨床經(jīng)驗，結(jié)合石氏傷科理論，創(chuàng)立施氏熱痹方，旨在益氣活血、清熱利濕，取得了良好的臨床療效[6]。因此，深入揭示益氣化瘀補(bǔ)腎方的藥物生效機(jī)制將為其在臨床上的推廣應(yīng)用提供強(qiáng)大的理論支撐。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是具有整體性與系統(tǒng)性的一門學(xué)科，這兩個特點契合中醫(yī)藥的辨證論治、整體觀等基本理論，可以很好闡述中醫(yī)藥的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制[7]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討益氣化瘀補(bǔ)腎方治療骨延遲愈合的主要有效化合物、作用靶點、作用通路，從而為骨延遲愈合的治療提供可行的思路。現(xiàn)報道如下：

1 工具與方法

1.1 藥物中活性成分及作用靶點的篩選 在TCMSP （Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology） 數(shù) 據(jù) 庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）中搜索本復(fù)方中藥物所含有的化學(xué)成分，并對候選化學(xué)成分進(jìn)行篩選，條件為類藥性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%，其中收錄有當(dāng)歸、川芎、桃紅、紅花、黃芪、丹參、肉蓯蓉、黨參、淫羊藿、蒼術(shù)、赤芍。但生地黃、補(bǔ)骨脂成分未收錄其中，因此再次將兩味中藥所含化學(xué)成分，通過TCMID 數(shù)據(jù)庫檢索，并添補(bǔ)方中所含其他中藥的化學(xué)成分。將得到的化學(xué)成分再次基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，以DL≥0.18、OB≥30%為條件，此條件與之前相同，將有效成分篩選出來后，整合以上操作所檢索出的所有藥物數(shù)據(jù)，獲得本方中所含有的化合物。將復(fù)方化合物的潛在靶點用TCMSP 平臺檢索，將靶點蛋白名稱基于String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）檢索，設(shè)定物種為人（homosapiens），將非人類的所有靶點排除，并取得蛋白的Gene Symbol。

1.2 疾病相關(guān)靶點的收集 將關(guān)鍵詞delay fracture union 相關(guān)靶點使用OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）、Genecards 數(shù) 據(jù) 庫（https://www.genecards.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/）檢索。

1.3 藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 在Cytoscape 3.7.2 軟件（http://www.cytoscape.org/）中通過交集疾病靶點和藥物靶點，從而構(gòu)建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，使用Network Analyzer 工具進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。

1.4 靶點蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 具有高置信度的交集靶點蛋白交互作用信息通過String 數(shù)據(jù)庫取得，將這些交集靶點蛋白的信息使用Cytoscape軟件構(gòu)建交互作用網(wǎng)絡(luò)（Protein Protein Interaction Network,PPI Network），并采用Network Analyzer 工具來進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。

1.5 靶點的生物功能富集分析 采用Bioconductor（www.bioconductor.org/） 中 的R 包（https://www.r-project.org/）cluster profile version 3.12.0 進(jìn) 行KEGG 通路富集分析（KEGG Pathway Analysis）和GO（Gene Ontology）功能富集分析，分析對象為潛在作用靶點，設(shè)定閾值P＜0.05，選擇的通路與骨延遲愈合相關(guān)，在Cytoscape 軟件中構(gòu)建靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 益氣化瘀補(bǔ)腎方的活性成分以及藥物-潛在靶點網(wǎng)絡(luò) 以TCMID 和TCMSP 平臺篩選益氣化瘀補(bǔ)腎方中藥活性成分，黃芪20 個活性化合物、黨參21 個、肉蓯蓉6 個、蒼術(shù)9 個、丹參65 個、當(dāng)歸2個、紅花22 個、川芎7 個、桃仁22 個、淫羊藿23 個、赤芍29 個，生地黃4 個、補(bǔ)骨脂3 個，去除重復(fù)后，活性成分共篩選出154 種，共251 個藥物靶點。共909 個“delay fracture union”相關(guān)靶點，以及84 個藥物和疾病的交集靶點基于OMIM 數(shù)據(jù)庫、GeneCards 數(shù)據(jù)庫篩選出來。通過Cytoscape 軟件所構(gòu)建的藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，共有144 個節(jié)點和835 條邊在此網(wǎng)絡(luò)中。見圖1。拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果表明，網(wǎng)絡(luò)度值（Degree）中位數(shù)2 倍值為4，緊密中心性（Closeness Centrality,CC）中位數(shù)為0.387 722 13，介度中心性（Betweenness Centrality, BC） 中位數(shù)為0.001 202 195，活性成分中滿足上述拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)的有Kaempfero（山柰酚）、Luteolin（毛地黃黃酮）、Baicalein （黃芩甙元）、Wogonin （漢黃芩素）、Quercetin（槲皮素）、beta-carotene（β-胡蘿卜素）和ellagic acid（鞣花酸）等56 種活性成分，這些分子能在4 個以上的交集靶點發(fā)生效應(yīng)，其效應(yīng)可能對治療作用影響較重要，因此核心活性成分選取以上活性成分。上述活性成分信息見表1。

圖1 益氣化瘀補(bǔ)腎方藥物-潛在靶點網(wǎng)絡(luò)

表1 益氣化瘀補(bǔ)腎方核心活性成分拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)信息

續(xù)表

2.2 靶點蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò) 基于String 數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 軟件構(gòu)建高置信度交集靶點蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點的顏色和直徑與此節(jié)點Degree 值成正相關(guān)，顏色越深，直徑越大，Degree 值越高，共有1 235條邊和84 個節(jié)點在此網(wǎng)絡(luò)中。見圖2。拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果見表2。網(wǎng)絡(luò)BC 中位數(shù)為0.001 179 64，Degree中位數(shù)為29，CC 中位數(shù)為0.630 032 205，ALB（血清白蛋白）、IL-6（白介素-6）、CASP3（胱天蛋白酶3）、EGF（表皮生長因子）、EGFR（表皮生長因子受體）、PTGS2（前列腺素G/H 合成酶2）、IL-1B（白介素 -1B）、ESR1 （ 雌 激 素 受 體 1）、CCND1（G1/S-specific 周期蛋白D1）等24 個靶點滿足上述參數(shù)卡值，可作為治療作用的核心靶點，在治療作用中有可能占據(jù)了重要地位。

表2 24 個核心靶點蛋白拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)信息

圖2 益氣化瘀補(bǔ)腎方治療骨延遲愈合靶點蛋白高置信度PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.3 富集分析 128 個分子功能（Molecular Function, MF） 條 目、60 個 細(xì) 胞 組 分（Cellular Component,CC）條目和1 980 個P≤0.05 的生物過程（Biological Processes,BP）條目和總共2 168 個條目通過GO 富集獲得，這些條目涉及到的作用主要有凋亡信號通路的調(diào)控、對類固醇激素的反應(yīng)、活性氧代謝過程、對氧水平的反應(yīng)等，選取分子功能、細(xì)胞組分以及生物過程P值最小的前10 個條目進(jìn)行作圖。見圖3。其中橫坐標(biāo)代表GOID，縱坐標(biāo)代表富集的基因數(shù)目。表3 展示了以上30 個生物學(xué)過程富集信息。133 條P≤0.05 的信號通路利用KEGG 富集獲得。見圖4。主要以涉及糖尿病并發(fā)癥的晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE）信號通路、前列腺癌、膀胱癌、卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、丙型肝炎、胰腺癌、人類巨細(xì)胞病毒感染、IL-17 信號通路、麻疹、p53 信號通路、內(nèi)分泌的阻力、結(jié)腸直腸癌、HIF-1 信號通路等為其中較為顯著的生物學(xué)富集通路。其中以橫坐標(biāo)代表該通路富集的基因數(shù)目，以縱坐標(biāo)代表富集的顯著生物學(xué)通路，P值的大小通過顏色的深淺代表。該生物學(xué)通路的P值越小、越顯著則表現(xiàn)出的顏色越紅。通過Cytoscape 軟件將P值前20 的信號通路構(gòu)建“靶點-通路”。見圖5。從圖中可見益氣化瘀補(bǔ)腎方治療骨延遲愈合的可能靶點在多個不同的代謝通路分布，聯(lián)手調(diào)節(jié)機(jī)體水平，反映了益氣化瘀補(bǔ)腎方多成分、多靶點治療骨延遲愈合的作用機(jī)制。

圖4 益氣化瘀補(bǔ)腎方治療骨延遲愈合的KEGG 富集分析圖

圖5 益氣化瘀補(bǔ)腎方治療骨延遲愈合-靶點-通路圖

表3 益氣化瘀補(bǔ)腎方治療骨延遲愈合的GO 富集分析信息

圖3 益氣化瘀補(bǔ)腎方治療骨延遲愈合的GO 富集分析圖

3 討論

腎中精氣為骨生長發(fā)育的根本，肝主筋，腎主骨生髓，人至中老年體質(zhì)虛弱，耗傷腎精，致腎精虧虛，精虧髓減，腎氣不足，氣機(jī)升降失常，血行不暢而致瘀血，血瘀進(jìn)一步影響氣的生成和運行，腎氣愈虛。

益氣化瘀補(bǔ)腎方是施杞教授基于石氏傷科“以氣為主，以血為先，痰瘀兼顧，肝腎同治”理念，結(jié)合“益氣、化瘀、補(bǔ)腎”的治法所創(chuàng)立，由黃芪、黨參、當(dāng)歸、川芎、桃紅、紅花、丹參、肉蓯蓉、淫羊藿、蒼術(shù)、赤芍、生地黃、補(bǔ)骨脂共十三味藥組成?！度杖A子本草》認(rèn)為黃芪“助氣壯筋骨，長肉，補(bǔ)血，破瘕癖”。益氣化瘀補(bǔ)腎方中黃芪、川芎益氣活血，為君藥；黨參、丹參活血化瘀，為臣藥；肉蓯蓉、補(bǔ)骨脂滋補(bǔ)肝腎，為佐藥。全方共奏益氣化瘀、補(bǔ)腎通絡(luò)之功效。現(xiàn)代藥理研究顯示，黃芪的主要成分黃芪多糖對成骨細(xì)胞增殖、活性有雙向調(diào)節(jié)作用；黃芪、川芎具有增強(qiáng)骨小梁面積及數(shù)目、增加松質(zhì)骨骨密度的作用；黨參、丹參具有抗骨質(zhì)疏松的功效；肉蓯蓉、補(bǔ)骨脂具有增加成骨細(xì)胞數(shù)量的作用。方中活性成分達(dá)到154 種，通過84 個交集靶點和154 種活性成分構(gòu)建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，顯示成分中的Quercetin （槲皮素）、Luteolin （毛地黃黃酮）、Kaempfero（山柰酚）、Wogonin（漢黃芩素）、Baicalein（黃芩甙元）、beta-carotene（β-胡蘿卜素）和ellagic acid（鞣花酸）等56 種活性成分可能是益氣化瘀補(bǔ)腎方的關(guān)鍵活性成分，是其發(fā)揮治療骨延遲愈合作用的關(guān)鍵。槲皮素是本研究中主要活性成分度值排名最高的，其作為黃酮醇類化合物，具有多種生物活性，廣泛分布于植物界，能發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗病毒、降糖、抗腫瘤、降脂、調(diào)節(jié)免疫等多種作用[8～9]。實驗研究發(fā)現(xiàn)槲皮素處理后骨鈣素增加，骨源性堿性磷酸酶及雌二醇存在減少，槲皮素可以顯著影響骨質(zhì)疏松大鼠及小鼠的骨代謝，促進(jìn)成骨[10～11]，同時也促進(jìn)老年性骨質(zhì)疏松患者的骨代謝指標(biāo)，提高老年患者臨床治療效果[12～13]。毛地黃黃酮與槲皮素同屬總黃酮類，具有殺菌、消炎、收斂功能[14]。山萘酚可通過調(diào)節(jié)Ca2+代謝平衡，促進(jìn)骨膠原生成，減少骨小梁丟失、增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的生長[15～16]。

PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，益氣化瘀補(bǔ)腎方治療骨延遲愈合的核心靶點包括ALB、IL-6、CASP3、EGF、EGFR、PTGS2、IL-1B、ESR1、CCND1 等24 個。ALB是評估機(jī)體營養(yǎng)狀況的重要指標(biāo)，機(jī)體營養(yǎng)不良易造成患者感染的概率上升[17]。IL-6 作為重要的炎癥參與因子，增加TNF-α 參與組織損傷，誘導(dǎo)產(chǎn)生前列腺素誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)是其誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要機(jī)制。Casp3 則是比較特殊的靶點，Casp3 主要編碼細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵蛋白酶[18～20]，EGF 是一種由53 個氨基酸殘基組成的耐熱單鏈低分子多肽，EGF與靶細(xì)胞上的EGF 受體特異性識別結(jié)合后，發(fā)生一系列生化反應(yīng)，最終可促進(jìn)靶細(xì)胞的DNA 合成及有絲分裂[21]，促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織修復(fù)[22]。EGF 無糖基部位，非常穩(wěn)定，耐熱耐酸，廣泛存在于體液和多種腺體中，主要由頜下腺、十二指腸合成，在人體的絕大多數(shù)體液中均已發(fā)現(xiàn)，在乳汁、尿液、精液中的含量特異性地增高，但在血清中的濃度較低[23]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用[24～25]。這些結(jié)果提示，益氣化瘀補(bǔ)腎方可能通過軟骨細(xì)胞凋亡、調(diào)控機(jī)體營養(yǎng)水平、細(xì)胞自噬或凋亡/炎癥細(xì)胞因子激活等途徑的靶點發(fā)揮治療骨延遲愈合作用。

通過KEGG 通路富集分析的結(jié)果可以看出，益氣化瘀補(bǔ)腎方對骨延遲愈合的干預(yù)機(jī)制最有可能與涉及糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號通路、前列腺癌、膀胱癌、卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、丙型肝炎、胰腺癌、人類巨細(xì)胞病毒感染、IL-17 信號通路、麻疹、p53 信號通路、內(nèi)分泌的阻力、結(jié)腸直腸癌、HIF-1α 信號通路等相關(guān)，GO 分析結(jié)果表明，益氣化瘀補(bǔ)腎方干預(yù)骨延遲愈合過程在生物過程方面最可能與對營養(yǎng)水平、金屬離子及抗生素的反應(yīng)相關(guān)，在細(xì)胞組分方面最有可能與囊泡、膜區(qū)、膜促性腺激素等相關(guān)，而在分子功能方面則最可能與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等相關(guān)。綜上所述，對益氣化瘀補(bǔ)腎方進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究表明該方通過多個成分作用于多個靶點、多條通路聯(lián)合實現(xiàn)對骨延遲愈合的治療作用。這些靶點和通路的作用主要涉及機(jī)體營養(yǎng)水平、細(xì)胞凋亡、致炎因子、細(xì)胞生長因子、VEGF 等，提示益氣化瘀補(bǔ)腎方治療骨延遲愈合的作用機(jī)制與調(diào)節(jié)機(jī)體營養(yǎng)水平、抗炎、促進(jìn)血管新生、干預(yù)細(xì)胞凋亡相關(guān)，為后期深入研究益氣化瘀補(bǔ)腎方治療骨延遲愈合提供了理論基礎(chǔ)。