劉茂希，杜昆利

(1.山西省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科，山西 太原 030013；2.第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院消化外科，陜西 西安 710032)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其嚴(yán)重危害著人類健康。以手術(shù)為主的綜合治療明顯改善了結(jié)直腸癌的生存率，但是其總體生存率仍有待提高，因此尋找新的結(jié)直腸癌治療方案迫在眉睫。探討結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)是目前的研究熱點(diǎn)之一。磷脂酶D2(PLD2)作為PLD家族的重要成員之一，在多種腫瘤中發(fā)揮了重要作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PLD2在結(jié)直腸癌組織中的蛋白和mRNA表達(dá)水平升高，并且其與結(jié)直腸癌患者的腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存率等相關(guān)[1]，且其在結(jié)直腸癌中起到抑制凋亡的作用[2]。然而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，干擾PLD2基因表達(dá)是否對(duì)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)有影響，目前尚鮮見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)構(gòu)建結(jié)直腸癌裸鼠轉(zhuǎn)移瘤模型，構(gòu)建PLD2特異性小干擾RNA(ad-PLD2-siRNA)的表達(dá)載體注射裸鼠移植瘤，探討應(yīng)用RNA干擾法下調(diào)結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤中PLD2表達(dá)水平對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，期望能為結(jié)直腸癌的基因治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 30只BALB/c雄性裸鼠，SPF級(jí)，鼠齡4～5周，體重16～20 g,由山西省腫瘤醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2細(xì)胞和腺病毒 SW480和SW620細(xì)胞由本課題組前期凍存；ad-PLD2-siRNA腺病毒載體由上海漢恒生物技術(shù)有限公司構(gòu)建和鑒定；本研究干擾PLD2有效的PLD2-siRNA靶序列為：5′-GAT GAG ATT GTG GAC AGA ATC CTG-3′。只帶腺病毒載體而無(wú)有效序列的腺病毒作為陰性對(duì)照。

1.1.3試劑 胎牛血清和RPMI1640；PLD2抗體(美國(guó)Abcam公司)；β-actin、c-Myc和Bcl-2抗體購(gòu)自武漢三鷹生物科技有限公司；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量反應(yīng)試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；蛋白提取試劑盒、蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液及PVDF膜購(gòu)自中國(guó)碧云天生物科技有限公司；裸鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將SW480或SW620置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，5%CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞(5×105mL)，接種到6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h貼壁后，棄培養(yǎng)液，加入用培養(yǎng)液稀釋的攜帶PLD2-siRNA的腺病毒載體或空載體[SW480的感染復(fù)數(shù)(MOI)=40；SW620的MOI=60]，細(xì)胞轉(zhuǎn)染4 h后，更換培養(yǎng)液并培養(yǎng)24 h，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況并進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2建立結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤模型 (1)所有動(dòng)物均先飼養(yǎng)7 d，離心消化SW480和SW620細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸并計(jì)數(shù)細(xì)胞使得每100微升PBS中至少重懸的細(xì)胞個(gè)數(shù)為3×106，并裝在EP管中備用。(2)酒精消毒小鼠右側(cè)背部皮膚，用1 mL注射器從EP管中吸凈細(xì)胞并注射在裸鼠右側(cè)后背部皮下，棉簽輕壓注射部位10 s，2種結(jié)直腸癌細(xì)胞株均注射10只。(3)用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體的橫徑(L)和縱徑(S)，每3天1次，根據(jù)公式0.5×L×S2計(jì)算腫瘤體積。(4)當(dāng)腫瘤體積達(dá)到50～70 mm3時(shí)，瘤體內(nèi)多方向注射攜帶人PLD2-siRNA腺病毒或空病毒載體或生理鹽水，從而將2種細(xì)胞株均分為PLD2干擾組、空載組和正常組，每組各5只，第1次注射后每3天1次，共8次后處死裸鼠，分離腫瘤，稱重。每個(gè)瘤體取一部分保存于液氮以備后續(xù)蛋白和mRNA檢測(cè)用；一部分用4%的甲醛固定，以備后續(xù)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色時(shí)用。實(shí)驗(yàn)期間仍每3天測(cè)量瘤體的L和S。(5)根據(jù)所測(cè)的最大L和最大S，計(jì)算腫瘤體積并繪制生長(zhǎng)曲線。(6)比較2種細(xì)胞株2組間的瘤體體積。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法 按照蛋白提取試劑盒的相關(guān)說(shuō)明提取各組蛋白，測(cè)定蛋白濃度。將各組蛋白(50 μg)在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，分離蛋白質(zhì)樣本，將蛋白質(zhì)樣本電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，然后孵育二抗2 h，洗膜后用ECL液在Fushison成像系統(tǒng)中進(jìn)行顯影攝像，之后利用該系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)水平分析。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照RNA提取試劑盒的相關(guān)說(shuō)明提取各組總RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄。PLD2引物的序列，上游為：5′-GTGGGCGATGAGATTGTGGAC-3′；下游為：5′-CAGGATTGAATACCCCCAC GA-3′。β-actin引物序列，上游為：5′-CCACAAATC TCCTCAACTCC-3′；下游為：5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′。熒光定量PCR采用SYBR?Premix EX TaqTMⅡ，按照試劑盒的相關(guān)說(shuō)明進(jìn)行。目的基因mRNA相對(duì)于β-actin mRNA的相對(duì)表達(dá)量按公式2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算，重復(fù)3次的平均值代表目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1腺病毒轉(zhuǎn)染效率 腺病毒轉(zhuǎn)染SW480和SW620細(xì)胞24 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%，見圖1。

A、C分別為明視野下的SW620和SW480；B、D分別為綠色視野下的SW620和SW480。圖1 腺病毒轉(zhuǎn)染SW620和SW480后熒光顯微鏡圖(200×)

2.22種細(xì)胞各組瘤體組織PLD2 mRNA表達(dá)水平比較 2種細(xì)胞PLD2干擾組的PLD2 mRNA表達(dá)水平與正常組和空載組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2種細(xì)胞正常組與空載組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

與正常組比較，aP>0.05；與正常組和空載組比較，bP<0.05。圖2 2種細(xì)胞各組瘤體組織PLD2 mRNA表達(dá)水平比較

2.32種細(xì)胞瘤體組織PLD2蛋白表達(dá)水平比較 2種細(xì)胞PLD2 干擾組PLD2蛋白表達(dá)水平與正常組和空載組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2種細(xì)胞正常組PLD2蛋白的表達(dá)水平與空載組比較無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

與正常組比較，aP>0.05；與正常組和空載組比較，bP<0.05。圖3 2種細(xì)胞各組瘤體組織PLD2蛋白表達(dá)水平比較

2.42種細(xì)胞各組瘤體體積比較 通過(guò)繪制瘤體的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)從第21天開始PLD2干擾組的瘤體體積開始小于空載組和正常組(P<0.05)，然而空載組和正常組間體積無(wú)差異(P>0.05)，見圖4A；瘤體體積的比較，發(fā)現(xiàn)PLD2干擾組瘤體體積顯著低于空載組和正常組(P<0.05)，而正常組和對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，見圖4B。這些研究結(jié)果提示干擾PLD2基因表達(dá)可以抑制結(jié)腸癌的生長(zhǎng)。

A.瘤體生長(zhǎng)曲線；B.瘤體體積；C.各組瘤體體積比較條形圖。與正常組比較，aP>0.05；與正常組和空載組比較，bP<0.05。圖4 2種細(xì)胞各組瘤體體積比較

2.5干擾PLD2基因表達(dá)對(duì)瘤體組織c-Myc和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響 PLD2干擾組c-Myc的蛋白表達(dá)水平與正常組和空載組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而Bcl-2的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；而正常組和空載組比較兩者的表達(dá)水平無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

與正常組比較，aP>0.05；與正常組和空載組比較，bP<0.05。圖5 2種細(xì)胞各組瘤體組織c-Myc和Bcl-2蛋白 表達(dá)水平比較

3 討 論

結(jié)直腸癌作為常見的消化道實(shí)體腫瘤之一，缺氧是其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的固有特點(diǎn)[3]。腫瘤細(xì)胞通過(guò)一系列機(jī)制調(diào)節(jié)自己以適應(yīng)缺氧的微環(huán)境并得以生存。WU等[4]通過(guò)干擾缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)基因后進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PLD2表達(dá)水平下降明顯，提示PLD2可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

PLD2作為磷脂酶家族重要成員之一，其催化磷脂酰膽堿為磷脂和膽堿，后兩者可參與一系列信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)從而參與多種生理和病理過(guò)程。過(guò)去的研究證實(shí)PLD在多種腫瘤中發(fā)揮作用，但是對(duì)于其在腫瘤中的具體作用目前依然尚未完全闡明。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)PLD2在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)水平升高，且PLD2與結(jié)直腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、TNM分期等呈正相關(guān)[1]。因此，推測(cè)PLD2可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。目前尚鮮見應(yīng)用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)探討PLD2對(duì)結(jié)直腸癌生長(zhǎng)影響的相關(guān)報(bào)道。為了探討這一科學(xué)問(wèn)題，本課題組選擇裸鼠作為本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。由于裸鼠無(wú)胸腺和T細(xì)胞功能完全缺失導(dǎo)致對(duì)移植物不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，目前用于人類腫瘤異種移植已被學(xué)者們所接受[5]，此外RYGARRD已經(jīng)于1969年成功建立了該移植瘤模型[6]。本研究通過(guò)建立結(jié)直腸癌裸鼠腺病毒移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)干擾降低PLD2基因的表達(dá)可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。在注射腺病毒后的即第21天開始，PLD2干擾組的瘤體即顯著小于對(duì)照組，表明PLD2可能促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。YAO等[7]報(bào)道PLD可以通過(guò)c-Src相互作用協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞的增殖；過(guò)表達(dá)PLD2的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)特性和形態(tài)學(xué)變化發(fā)生改變后，表現(xiàn)出惡性轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)，即處于S期細(xì)胞比例增加和細(xì)胞周期素D3的表達(dá)上調(diào)[8]，顯示PLD2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。此外，PLD2可以激活mTOR通路調(diào)控多種蛋白的合成促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)[9-11]。有研究也報(bào)道核因子-κB可以介導(dǎo)PLD促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[12-13]。這些結(jié)果說(shuō)明PLD2處于多條信號(hào)通路交匯點(diǎn)，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)PLD2表達(dá)水平和活性升高，并且HIF-1α可以調(diào)控PLD2的表達(dá)[1]；有報(bào)道指出慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中PLD2可以調(diào)控HIF-1α的表達(dá)[14-15]。因此，推測(cè)這兩者之間也可能存在Cross-talk的現(xiàn)象，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。不管怎樣，這些結(jié)果說(shuō)明高表達(dá)的PLD2促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生。目前關(guān)于PLD2調(diào)控結(jié)腸癌生長(zhǎng)的靶基因尚未明確。已有文獻(xiàn)報(bào)道c-Myc和Bcl-2在結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。那么PLD2是否可以通過(guò)對(duì)c-Myc和Bcl-2的影響來(lái)調(diào)控結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)呢，現(xiàn)有的相關(guān)資料尚不能證實(shí)這一科學(xué)問(wèn)題。為了說(shuō)明這個(gè)問(wèn)題，本研究通過(guò)腺病毒干擾降低PLD2基因表達(dá)，檢測(cè)c-Myc和Bcl-2表達(dá)水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著PLD2表達(dá)水平的降低，c-Myc蛋白表達(dá)水平也下降，而Bcl-2的表達(dá)水平升高，提示PLD2可能通過(guò)調(diào)控c-Myc和Bcl-2表達(dá)來(lái)調(diào)控結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)。

綜上所述，在結(jié)直腸癌中高表達(dá)的PLD2可能通過(guò)調(diào)控c-Myc和Bcl-2表達(dá)來(lái)參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的發(fā)生，本研究顯示PLD2可能成為結(jié)直腸癌靶向治療的新靶點(diǎn)。但是PLD2作用的具體分子機(jī)制和信號(hào)通路還有待進(jìn)一步深入研究。