楊澤毅，張玉琳，楊寒珺，車 冰，張凡凡*，馬春暉*

(1. 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 石河子 新疆 832000； 2. 新疆青牧力生物科技有限公司， 石河子 新疆 832000)

葡萄(Vitisvinifera)是我國六大水果之一，其產(chǎn)量、栽培面積占全國果樹總量的第4位，在我國水果生產(chǎn)中占據(jù)重要地位；其中新疆作為我國葡萄主要產(chǎn)區(qū)，鮮食及釀酒葡萄栽培面積達(dá)220萬畝以上，占全疆水果生產(chǎn)的1/3以上，產(chǎn)業(yè)化基礎(chǔ)相對雄厚[1]；而作為新疆地區(qū)農(nóng)牧民賴以生存的畜牧業(yè)，正面臨“種草無人、草品低下”的產(chǎn)業(yè)困境；此外，在國家及地方“畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展”政策實(shí)施的背景下，反芻動(dòng)物養(yǎng)殖逐步由散養(yǎng)、放牧方式向舍飼、半舍飼方式轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致地區(qū)飼料短缺問題越發(fā)嚴(yán)重。因此，合理利用葡萄副產(chǎn)品資源，可有效緩解種草養(yǎng)畜壓力，豐富家畜粗飼料來源，為地區(qū)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供基礎(chǔ)。

葡萄副產(chǎn)品資源主要包括葡萄皮渣、葡萄枝葉等。目前大量研究證實(shí)，葡萄皮渣中含有豐富營養(yǎng)、抗氧化物質(zhì)等，作為牛羊發(fā)酵飼料不僅可有效提高乳、肉品質(zhì)，而且能顯著提高家畜免疫性、抗氧化性等[2-4]，因而已被廣泛應(yīng)用。葡萄枝葉主要為葡萄冬剪后的全部枝葉(800 kg·m-2)，其中含有豐富的糖源、多酚、蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)[5-8]，而本地區(qū)尚無合理利用方式，主要采用粉碎還田或焚燒的方式處理，導(dǎo)致大量資源的浪費(fèi)且造成環(huán)境污染。如將葡萄枝葉調(diào)制成青貯飼料，不僅可最大化保存其營養(yǎng)物質(zhì)，改善家畜適口性，且可提高粗飼料資源的利用效率[9]。

乳酸菌是主導(dǎo)青貯發(fā)酵的關(guān)鍵，其可改善青貯原料中的微生物區(qū)系、優(yōu)化發(fā)酵進(jìn)程，進(jìn)而確保青貯養(yǎng)分的保存，而其中乳酸菌類型、多樣性、活性以及數(shù)量均會(huì)影響青貯的發(fā)酵品質(zhì)[10-11]。青貯過程中乳酸菌根據(jù)其發(fā)酵葡萄糖的形式分為同質(zhì)型乳酸菌和異質(zhì)型乳酸菌，同質(zhì)性乳酸菌通過糖酵解(EMP)途徑產(chǎn)生乳酸，其在發(fā)酵過程中能夠快速積累大量乳酸，降低發(fā)酵體系pH值，抑制其他有害微生物生長，且能夠減緩蛋白類物質(zhì)的腐敗[12-13]；異質(zhì)性乳酸菌通過磷酸解酮酶(PP)途徑產(chǎn)生乙酸、乳酸等，其雖比同質(zhì)型乳酸菌產(chǎn)酸能力差，但在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸等揮發(fā)性脂肪酸能有效減緩青貯二次發(fā)酵，提高青貯的有氧穩(wěn)定性[13-14]。對于葡萄枝葉自然青貯過程，雖底物營養(yǎng)物質(zhì)豐富[15]，但發(fā)酵過程中優(yōu)良乳酸菌的種類及其對不同糖源酵解的方式是青貯能否進(jìn)一步改善的關(guān)鍵。目前已有諸多關(guān)于牧草中天然附著乳酸菌分離及其在青貯中的應(yīng)用的研究，其已篩選出多種具有較強(qiáng)的耐低溫、耐鹽、產(chǎn)酸能力的乳酸菌菌株[16-17]，而對于葡萄枝葉自然青貯中優(yōu)勢乳酸菌的研究較少。鑒于此，本研究通過對葡萄枝葉自然青貯過程中的優(yōu)勢乳酸菌進(jìn)行分離、篩選和生物學(xué)特性研究，為葡萄枝葉資源的青貯飼料化利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 青貯飼料樣品

選擇種植于新疆石河子市第八師152團(tuán)葡萄種植1號(hào)地(86°1′26″ N，44°13′58″ E)釀酒用葡萄‘白玉霓’和‘煙73’的枝葉做為青貯原料，將其粉碎至1～1.5 cm，稱取2 kg裝入16 cm×25 cm真空袋中，共調(diào)制20袋。經(jīng)真空封口機(jī)密封后，置于18～23℃條件下，自然發(fā)酵60 d。

1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

試驗(yàn)所用MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基購置于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，M17肉湯培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、革蘭氏染色液試劑盒、糖微量發(fā)酵管購置于北京緣生化科技有限公司，細(xì)菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.3 乳酸菌的分離與純化

分別在發(fā)酵第3，7，15，60 d，稱取10 g葡萄枝葉青貯樣品放入90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，密封，置于搖床上以120 r·min-1搖動(dòng)2 h(37℃)，在無菌操作臺(tái)中，吸取1 mL上清液加入到9 mL無菌生理鹽水中，漩渦振蕩，以此稀釋成4個(gè)梯度(10-8～10-5)，分別取4個(gè)梯度的菌液100 μL涂布于固體MRS平板培養(yǎng)基和M17平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48～72 h，觀察菌落的形態(tài)、大小、顏色和光澤，選擇典型的鈣溶性環(huán)菌落進(jìn)行革蘭氏染色、油鏡和過氧化氫酶接觸試驗(yàn)。經(jīng)過革蘭氏染色(呈陽性)和過氧化氫酶(呈陰性)試驗(yàn)，初步判斷乳酸菌種類。接著在MRS固體培養(yǎng)基和M17固體培養(yǎng)基上劃線，恒溫培養(yǎng)30℃，48～72 h，重復(fù)劃線分離培養(yǎng)3次，得到純化的單菌株。用MRS液體培養(yǎng)基和M17液體培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)(30℃，24 h)，與甘油1∶1等體積混合，封裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 乳酸菌的鑒定

1.4.1測定生長曲線 將分離純化的乳酸菌菌液混勻并提取其懸液以6%的濃度接種至MRS培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)(37℃)24 h，期間每2 h用紫外可見分光光度計(jì)(日立，U-2910)測其在波長600 nm的OD值，每個(gè)菌種均重復(fù)3次，最終將測定結(jié)果繪制生長曲線。

1.4.2產(chǎn)酸速率測定 將乳酸菌菌液混勻，提取其懸液以3.0 %的濃度接種于pH 6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，恒溫(37℃)培養(yǎng)24 h，期間每2 h用pH計(jì)(上海雷磁儀器有限公司)測發(fā)酵液的pH值，每個(gè)菌種均重復(fù)3次，最終將測定結(jié)果繪制產(chǎn)酸速率曲線。

1.4.3生理生化鑒定 將保存?zhèn)溆玫娜樗峋昊罨?4 h后，參照凌代文[18]和劉慧[19]的方法進(jìn)行乳酸菌生理生化特性鑒定。將各乳酸菌菌株以3%的濃度接種于MRS液體培養(yǎng)基、M17液體培養(yǎng)基中，分別在4，10，30，45℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其中4℃培養(yǎng)10 d，10℃與30℃培養(yǎng)3 d，45℃培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)結(jié)束后觀察乳酸菌菌株對溫度的響應(yīng)情況。分別在pH值3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0以及濃度為3.0%和6.5% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基、M17液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48 h，觀察乳酸菌菌株對酸堿與鹽的耐受能力。主要采用用紫外可見分光光度計(jì)測定乳酸菌在波長600 nm的OD值，以判斷乳酸菌在不同環(huán)境下的生長情況(弱生長,0.21.0)。用細(xì)菌微量生化鑒定管(由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供)檢測乳酸菌菌株對18種碳源的利用情況。均重復(fù)測定3次。

1.4.4乳酸菌的16S rDNA序列測定 按照試劑盒法，提取純化乳酸菌菌株的DNA，DNA提取試劑盒由北京全世金生物技術(shù)有限公司提供。PCR擴(kuò)增引物采用細(xì)菌通用引物：FA-27F：5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGA

TCCTGGCTCAG-3′和RA-1495R：5′-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGGTACCTTGTT-ACGA-3′。PCR反應(yīng)體系為(50 μL)：DNA模板5 μL，引物27F和1495R(10 μmol·L-1)各1 μL，2×Master Mix 25 μL，dd H2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測及純化，將純化后產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2018對所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用Origin 2017軟件進(jìn)行相關(guān)繪圖，經(jīng)過測序后的乳酸菌16S rDNA序列在GenBank中進(jìn)行比對，采用MEGA 7.0軟件中的Clustal W對最近類群的序列進(jìn)行多重比較分析，并使用軟件中的鄰位歸并法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定各菌株分類地位[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌株的生理生化特性分析

葡萄枝葉自然青貯中分離并提純所得到的乳酸菌菌株，經(jīng)過鏡檢及生理生化特性鑒定表明，所有菌株革蘭氏染色均為陽性，觸酶實(shí)驗(yàn)呈陰性。各菌株鏡檢均呈單、對或成鏈排列的卵圓形或球形，無運(yùn)動(dòng)性、無芽孢，初步鑒定結(jié)果符合乳球菌(Lactococcusspp.)的生物學(xué)特性(圖1)。其中，Q1菌株在發(fā)酵葡萄糖過程中產(chǎn)氣，初步鑒定為異質(zhì)型乳酸菌；其他菌株發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，初步鑒定為同質(zhì)型乳酸菌(表1)。

圖1 葡萄枝葉自然青貯中乳酸菌革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 Gram staining results of lactic acid bacteria in natural silage of grape branches and leaves

通過各菌株在不同溫度的生長情況表明(表1)，4℃,10℃,30℃和45℃時(shí)，各菌株均表現(xiàn)出生長或微弱生長。各菌株均能在3%和6.5% NaCl條件下表現(xiàn)出良好的生長特性。在不同pH值條件下，各菌株均能在pH 3.5～9的范圍內(nèi)生長或微弱生長，其中僅Q1菌株在pH為9時(shí)不能生長。

表1 葡萄枝葉自然青貯中乳酸菌的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria in natural silage of grape branch and leaf

續(xù)表1

對初步篩選出的5株乳酸菌進(jìn)行18種碳源發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明(表2)，Q1除松三糖、纖維二糖無法利用外，其余糖、醇均可利用。Q2和Q5不能利用松三糖、鼠李糖、乳糖，棉子糖為可變反應(yīng)。Q3不能利用松三糖、鼠李糖、山梨醇、乳糖，棉子糖為可變反應(yīng)。Q4不能利用棉子糖、木糖、甘露醇、山梨醇、菊糖、鼠李糖，松三糖為可變反應(yīng)。

2.2 乳酸菌菌株16S rDNA基因序列分析

經(jīng)過BLAST比對，所篩選出的5株乳酸菌菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株相似性均達(dá)到97.5%以上。將各菌株與參考乳酸菌菌株共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明(圖2)，Q1與腸膜明串珠菌CJNU 0705(L.Mesenterica)，Q2與屎腸球菌R 12(E.faecium)，Q3與鉛黃色腸球菌AU11(E.casseliflavus)的親緣度為100%；Q4與海氏球菌1-W1-4(E.Hirae)，Q5與屎腸球菌FS 86(E.faecium)的親緣度為99%。根據(jù)16S rDNA基因序列的同源性分析的結(jié)果，Q1菌株確定為腸膜明串珠菌(L.Mesenterica)，Q2和Q5菌株為屎腸球菌(E.faecium)，Q3菌株為鉛黃色腸球菌(E.casseliflavus)，Q4菌株為海氏腸球菌(E.Hirae)。Q1，Q2，Q3，Q4，Q5在Genbank中的登錄號(hào)及用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的乳酸菌菌株見表3。

表2 葡萄枝葉自然青貯中乳酸菌碳源發(fā)酵試驗(yàn)Table 2 Fermentation test of lactic acid bacteria carbon sources in natural silage of grape branch and leaf

圖2 葡萄枝葉自然青貯中乳酸菌基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 16S rDNA-based phylogenetic tree of lactic acid bacteria in natural silage of grape branch and leaf

表3 葡萄枝葉自然青貯中乳酸菌菌株的16S rDNA基因序列分析結(jié)果Table 3 Analysis results of 16S rDNA gene sequence analysis of lactic acid bacteria strains in natural silage of grape branches and leaves

2.3 乳酸菌菌株的產(chǎn)酸速率及生長特性

通過對各乳酸菌菌株的產(chǎn)酸速率與生長速率分析，結(jié)果表明(圖3-A、圖3-B)，各菌種在培養(yǎng)4～6 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，所有菌株在12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，且24 h內(nèi)未見遲滯期，生長速率與產(chǎn)酸速率均成正比。菌株Q1、Q3在0～10 h產(chǎn)酸及生長速率基本相同；10 h后，Q1的產(chǎn)酸速率與生長速率繼續(xù)增加，而Q3的產(chǎn)酸速率明顯下降，最后均趨于平緩。0～6 h時(shí)Q2、Q4、Q5產(chǎn)酸及生長速率基本相同，而6 h后Q4生長速率高于其他菌株，12 h后各菌株生長速率均趨于平緩，24 h時(shí)，Q4菌株的數(shù)量最多(OD=1.42)。24 h內(nèi)，除Q3外的其余菌株pH值均在降到4.50以下；其中，Q4均產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，24 h時(shí)的pH值下降至4.11。

圖3 葡萄枝葉自然青貯中乳酸菌菌株的產(chǎn)酸速率及生長速率Fig.3 Acid production rate and growth rate of lactic acid bacteria strains in natural silage of grape branch and leaf

3 討論

3.1 葡萄枝葉自然青貯過程中乳酸菌的分離與鑒定

秸稈類植物在青貯過程中，其表面自然附著乳酸菌適應(yīng)能力更強(qiáng)，因此在青貯過程中起到不可替代的作用[21]。將植物表面附著優(yōu)良乳酸菌進(jìn)行分離，并用于青貯發(fā)酵則是一種高效而又快速的方法[21-22]，目前國內(nèi)外諸多青貯發(fā)酵劑，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、戊糖片球菌(Pedococcuspentosaceus)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)等，均篩選于自然發(fā)酵的青貯玉米。本研究采用微生物分子生物學(xué)鑒定法(16S rDNA序列分析法)，相比于傳統(tǒng)的微生物鑒定法更加準(zhǔn)確，其主要通過不不同菌種間16S rDNA可變區(qū)序列存在差異，而恒定區(qū)的序列基本保守這一特性設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增16S rDNA片段后，利用可變區(qū)序列的差異性，對不同菌種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定，對于界限較模糊的菌株，均能很好的進(jìn)行鑒定，更為客觀、方便、高效的解決菌種之間的分類問題[23]。如：腸膜明串珠菌(LeuconostocMesenterica)、類腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和假腸膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesentery)均屬于明串珠菌屬(Leuconostocspp.)，三者擁有相似的可發(fā)酵糖源，而采用本研究序列分析法能夠準(zhǔn)確的判斷出Q1為L.Mesenterica。此外，本研究中，通過5株乳酸菌菌株對18碳源發(fā)酵試驗(yàn)得出，Q1,Q2,Q4與Q5對于碳源的利用模式與模式菌株標(biāo)準(zhǔn)一致[18]。Q3不能利用松三糖、鼠李糖、山梨醇、乳糖，而模式株鉛黃色腸球菌(Enterococcuscasseliflavus)可發(fā)酵乳糖，這與標(biāo)準(zhǔn)不同，存在一定差異。由此進(jìn)一步證實(shí)，單獨(dú)采用生理生化標(biāo)準(zhǔn)鑒定乳酸菌種屬并不準(zhǔn)確，需結(jié)合分子生物學(xué)方法綜合鑒定。通過對本研究中的乳酸菌的16S rDNA序列在GenBank中進(jìn)行比對，Q1與L.Mesenterica序列相似性達(dá)到了99.36%，Q2和Q5與屎腸球菌(E.faecium)序列相似性分別為99.64%、98.31%，Q3與鉛黃色腸球菌(E.casseliflavus)序列相似性為97.96%，Q4與海氏腸球菌(E.Hirae)序列相似性為97.69%。本研究所篩選出的5株菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株的進(jìn)化親緣度均達(dá)到了99%以上。因此可確定Q1為L.Mesenterica，Q2、Q5為E.faecium，Q3為E.casseliflavus，Q4為海氏腸球菌E.Hirae。

3.2 葡萄枝葉自然青貯過程中分離乳酸菌的特征分析

產(chǎn)酸能力和生產(chǎn)速率都是衡量相同條件下乳酸菌利用資源發(fā)酵能力的重要參數(shù)，也是篩選適合發(fā)酵原料的優(yōu)良乳酸菌菌株的重要指標(biāo)[24]。本研究中所有乳酸菌菌株在發(fā)酵過程中遲滯期不明顯，說明在培養(yǎng)基溶液中生長繁殖速度快，乳酸菌數(shù)量增值迅速，起到了促進(jìn)發(fā)酵和快速降低pH值的作用[25]。以往研究表明，用于青貯發(fā)酵菌劑的微生物都具有統(tǒng)一的發(fā)酵途徑，可利用的可溶性碳水化合物較為廣泛，且可產(chǎn)生大量乳酸，適應(yīng)較大的溫度范圍，耐酸能力強(qiáng)，能快速降低pH值(4.2以下)至優(yōu)質(zhì)青貯標(biāo)準(zhǔn)，從而抑制其他有害微生物生長[26-27]。理論上看，本研究篩選的Q1、Q2、Q4、Q5均適合青貯飼料的發(fā)酵，而進(jìn)一步通過乳酸菌菌株在pH 3～9，4℃～45℃，3%和6.5% NaCl濃度不同環(huán)境下進(jìn)行生長，其目的就是初步篩選出擁有較強(qiáng)耐酸、耐鹽能力及擁有較廣生長溫度范圍的菌株，其中，E.Hirae在24 h內(nèi)均表現(xiàn)出最快的生長速率(圖3A)，這與以往在發(fā)酵酸奶中研究結(jié)果相同，其研究不僅證實(shí)了E.Hirae具有較快的生長速率；與食品用菌株嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)不產(chǎn)生拮抗作用，且還具一定益生作用[28]。E.Hirae在12 h內(nèi)產(chǎn)酸能力相對較弱，12～24 h才表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力(圖3B)，且對于酸性環(huán)境的耐受能力更強(qiáng)，即在pH=4的環(huán)境下依然能夠生長(表1)，其原因主要為E.Hirae對于發(fā)酵底物碳源的利用種類較少(表2)，本研究為理論條件(培養(yǎng)基環(huán)境)，缺乏合適的發(fā)酵底物和發(fā)酵環(huán)境；因此其在發(fā)酵飼料中的實(shí)際利用及多種益生性還有待繼續(xù)挖掘。

大量研究證實(shí)，乳酸菌作為青貯主要發(fā)酵菌種之一，除了能改善青貯品質(zhì)，還具有多種益生功能和抑菌作用[29-31]。本研究篩選的菌株均在我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料添加劑目錄(2045號(hào)公告)中，且在飼料工業(yè)方面大量應(yīng)用。其中，E.faecium添加至肉雞日糧中可有效改善腸道菌群并提高其生長性能，增強(qiáng)免疫功能，抑制細(xì)胞氧化衰老，降低氨氣的排放量[32-33]。L.Mesenterica作為乳酸菌中的重要菌種，具有相當(dāng)高的生物安全性，且分泌出的細(xì)菌素能抑制多種病原細(xì)菌的生長[34-35]；此外抑菌物質(zhì)能夠被乙酸乙酯萃取出，具有一定的熱穩(wěn)定性[32-33]。E.Hirae具有降低膽固醇的潛力，對銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、E.coli等腸道病原體有顯著的抑菌作用[36]，且可改善人體血脂，調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝[37]。此外，這些菌株在食品發(fā)酵工業(yè)和醫(yī)藥等方面也具有諸多潛在價(jià)值，而本研究僅進(jìn)行了乳酸菌的篩選鑒定，以及初步分析了5種乳酸菌的生理生化、碳源利用、生長和產(chǎn)酸特征，更多的功能性研究還有待挖掘。

4 結(jié)論

本研究從葡萄枝葉青貯中分離得到了5株乳酸菌菌株，均具有較強(qiáng)的耐鹽、耐酸能力，以及廣泛的溫度適應(yīng)范圍和碳源利用情況，其中Q1鑒定為腸系膜明串珠菌(L.Mesenterica)，Q2和Q5鑒定為屎腸球菌(E.faecium)，Q3鑒定為鉛黃色腸球菌(E.casseliflavus)，Q4鑒定為海氏腸球菌(E.Hirae)。其中，Q4菌株在培養(yǎng)至24 h后其菌液pH為4.13，OD值為1.40，表現(xiàn)出最強(qiáng)的產(chǎn)酸能力和生長速率。