龍仕和， 李雪楓， 潘俊歆， 常 曄， 史孟麗， 黃乃馨， 崔智海， 王 堅*

(1. 海南大學動物科技學院， 海南 海口 570228； 2. 海南大學林學院， 海南 海口 570228)

‘熱研4號’王草(Pennisetumpurpureum×P.americanum‘Reyan No.4’)是中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶牧草研究中心經(jīng)多年試驗選育而成的多年生禾本科牧草，為象草(Pennisetumpurpureum)和美洲狼尾草(Pennisetumtyphoideum)的雜交品種[1]。該草具有品質(zhì)好，生物產(chǎn)量高，光合作用強，可利用年限長，適應性和抗逆性強等特點，在廣東、海南、廣西和福建等熱帶亞熱帶地區(qū)廣泛種植[2]，常作為反芻動物的優(yōu)質(zhì)青綠飼料。在海南，夏、秋季節(jié)高溫多雨王草生長旺盛，產(chǎn)量高，家畜短期內(nèi)無法完全利用，因此，在王草生長旺盛季節(jié)將其調(diào)制成青貯飼料以緩解冬春季節(jié)飼料短缺成為確保反芻動物可持續(xù)發(fā)展的有效途徑。目前有關王草的青貯研究，眾多學者做了不少探討，如研究王草與不同農(nóng)副產(chǎn)品混合青貯[3-4]，王草青貯后的有氧穩(wěn)定性[5-6]，添加劑對王草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響[7-8]，不同刈割茬次王草表面附著的乳酸菌分布和青貯發(fā)酵品質(zhì)等[9-10]。

近年來，海南地區(qū)臺風、極端降水等氣候頻率增加，導致牧草無法及時收獲，生產(chǎn)者必須調(diào)整牧草收獲時間以避免經(jīng)濟損失。由于牧草在不同生長階段因其化學組分不同，進而影響其青貯發(fā)酵品質(zhì)，是影響牧草青貯品質(zhì)的主要因素之一[11-12]。牧草在生長早期含有較高的可溶性碳水化合物[13]，相較于晚收割的牧草其干物質(zhì)含量較低[14]，在青貯過程中容易引起梭菌發(fā)酵導致干物質(zhì)損失。牧草隨著生長時間延長，木質(zhì)化程度增加，可溶性碳水化合物含量下降不利于青貯發(fā)酵[15]。目前，關于不同生長天數(shù)王草的青貯發(fā)酵品質(zhì)和微生物群落的研究鮮有報道。本試驗擬對熱帶地區(qū)生長90，110，130 d的王草進行刈割青貯，研究其發(fā)酵品質(zhì)和微生物群落多樣性，以期為熱帶地區(qū)王草青貯飼料的調(diào)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原料為熱研4號王草(以下簡稱王草)，于2020年6月5日種植在海南大學熱帶農(nóng)林學院試驗田。該試驗基地位于海南大學海甸校區(qū)(19° 32′ N，109° 35′ E)，地處熱帶季風氣候區(qū)，年均氣溫22～26℃，年日照時間1 750～2 650 h，年均降水量1815 mm。基地0～20 cm深度土壤養(yǎng)分基本狀況為：pH值4.93，有機質(zhì)1.98%，全氮1.28 g·kg-1，全磷0.88 g·kg-1，全鉀3.61 g·kg-1，堿解氮51.97 mg·kg-1，速效鉀95.75 mg·kg-1，速效磷15.82 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗采用隨機區(qū)組設計，設3個處理組：KM90S組(生長90 d)、KM110S組(生長110 d)和KM130S組(生長130 d)，分別在青貯1，3，7，14和30 d后打開青貯袋取青貯飼料測定發(fā)酵品質(zhì)和化學成分，對30 d的青貯樣品進行微生物群落分析，每個處理各個青貯時間點3次重復。

1.3 試驗方法

1.3.1王草原料處理 王草分別在生長90，110，130 d后將其刈割并帶回實驗室，用滅菌后的鍘刀將原料切短至2～3 cm并充分混合，將混合好的王草隨機選取15份(5個青貯時間×3個重復)樣品(每份300 g)裝入聚乙烯袋中，抽真空、密封，在室溫下青貯。另取3份鮮樣(每份300 g)用于化學成分測定，3份(每份10 g)用于微生物計數(shù)。

1.3.2青貯樣品處理 分別在青貯第1，3，7，14，30 d后打開青貯袋，每個樣品混勻后取20 g青貯料于100 mL錐形瓶中，加入70 mL蒸餾水，于4℃冰箱中浸提24 h后用4層紗布過濾得到浸提液用于測定pH、有機酸和NH3-N含量。剩余青貯料裝入信封中于65℃烘箱干燥72 h，烘干后用粉樣機粉碎然后經(jīng)過40目篩用于測定化學成分。

1.3.3測定項目及方法 鮮樣和青貯樣置于65℃烘箱干燥72 h測定干物質(zhì)(Dry matter,DM)含量；pH用pH計(PHS-3C精密pH計)對浸提液直接測定；蒽酮-硫酸比色法[16]測定可溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrates,WSC)含量；中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)含量通過范氏纖維分析法[17]進行測定；苯酚-次氯酸鈉比色法[18]測定氨態(tài)氮(Ammonia nitrogen,NH3-N)含量；粗蛋白質(zhì)(Crude protein,CP)和總氮(Total nitrogen，TN)含量采用全自動凱氏定氮儀(K9860，山東海能科學儀器有限公司)進行測定；乳酸(Lactic acid,LA)、乙酸(Acetic acid,AA)、丙酸(Propionic acid,PA)和丁酸(Butyric acid,BA)含量通過高效液相色譜儀檢測(島津LC-20A,Carbomix H-NP,7.8 mm × 300 mm)，流動相：2.5 mmol·L-1H2SO4溶液；流速：0.6 mL·min-1；柱溫箱溫度：55℃；檢測器：SPD-M20A；檢測波長：210 nm；進樣體積：5 μL。

1.3.4微生物計數(shù) 采用平板培養(yǎng)方法進行微生物計數(shù)。取10 g新鮮樣品與100 mL無菌生理鹽水(8.5 g·L-1)混合后進行連續(xù)梯度稀釋(10-1至10-7)。乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)在MRS瓊脂(Solarbio Life Sciences Ltd. Co.,Beijing,China)上37℃厭氧培養(yǎng)24 h后計數(shù)。酵母和霉菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA;Solarbio Life Sciences Ltd. Co.,Beijing,China)上30℃有氧培養(yǎng)48 h后計數(shù)。腸桿菌在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRBA;Solarbio Life Sciences Ltd. Co.,Beijing,China)上37℃有氧培養(yǎng)72 h后計數(shù)。

1.3.5微生物總DNA的提取 王草青貯30 d后，將青貯袋打開并充分混合，取3個重復樣品，每個重復取20 g青貯料放入三角瓶，加入180 mL去離子水，三角瓶在37℃，120 r·min-1的搖床里均質(zhì)15 min，然后用四層紗布進行過濾，得到浸提液。取40 mL浸提液于8000 rpm離心15 min后棄掉上清液，用1 mL無菌PBS溶液將沉淀溶解并收集到1.5 mL離心管，然后在-20℃冰箱保存，用于總DNA的提取。

1.3.6PCR擴增及16S rRNA基因高通量測序 選用DNA提取試劑盒(DP302-02，天根生物技術(shù)有限公司)提取青貯飼料樣品中細菌的總DNA。利用前引物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)與后引物805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)獲取細菌V3～V4高變異區(qū)l6S rRNA基因。PCR擴增產(chǎn)物回收純化利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，采用lllumina公司的TruSeq TM DNA Sample PrepKit制備測序文庫。使用MiSeq測序儀進行2×300 bp的雙端測序并對結(jié)果進行分析，lllumina HiSeq測序及結(jié)果分析測序及序列物種信息由生工生物工程(上海)股份有限公司協(xié)助完成。使用Usearch軟件對測序序列進行聚類，對97%相似水平下的操作分類單元(OTU)進行生物信息統(tǒng)計分析。α多樣性(Alpha diversity)包括Shannon，Chao，Ace和Good's coverage指數(shù)通過Mothur計算。主成分分析(PCA)通過R軟件中的VEGEN包進行分析。優(yōu)勢物種相對豐度柱狀圖通過R軟件進行計算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用3(G)×6(E)完全隨機區(qū)組設計進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，每個處理3個重復。數(shù)據(jù)處理使用的模型為Yijk=μ+Ti+Cj+TCij+Eijk，其中，Yij=因變量值，μ=總體均值，Ti=生長天數(shù)效應，Cj=青貯時間效應，TCij=生長天數(shù)×青貯時間互作效應，Eijk=隨機誤差。對微生物計數(shù)以10為底的對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行數(shù)據(jù)分析，并以對數(shù)值表示。利用SPSS Statistics 26統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。使用Duncan’s法對均值進行多重比較。P<0.05表明數(shù)據(jù)差異顯著，0.05≤P<0.10為存在趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長天數(shù)王草原料化學特性及附著微生物數(shù)量

由表1可知，3組王草原料的WSC含量在40.28～71.76 g·kg-1DM之間。隨著生長天數(shù)延長，王草的DM含量顯著增加(143.92～217.11 g·kg-1DM)(P<0.05)，CP含量顯著降低(P<0.05)。ADF和NDF含量隨著生長天數(shù)延長總體呈上升趨勢(P>0.05)。KM90S，KM110S和KM130S組王草的LAB數(shù)量分別為4.72，4.49和4.39 lg cfu·g-1FM，酵母和霉菌的數(shù)量在3.05～4.07 lg cfu·g-1FM之間，KM90S和KM130S組的腸桿菌數(shù)量顯著高于KM110S組(P<0.05)。

表1 不同生長天數(shù)王草原料化學特性及微生物組成Table 1 Chemical characteristics and microbial populations of king grass in different growth days

2.2 王草青貯過程中發(fā)酵品質(zhì)的變化

由表2可知，KM110S和KM130S組的pH隨著青貯進行持續(xù)降低，均在青貯第30 d達到最低(P<0.05)。KM90S組的pH在青貯前7 d內(nèi)變化不大，在青貯第14～30 d顯著下降(P<0.05)。與青貯第1 d相比，KM90S組的LA含量在青貯前7 d變化不大(P>0.05)，隨后在青貯第14～30 d顯著增加(P<0.05)。KM110S和KM130S組的LA含量在整個青貯過程中持續(xù)增加，均在青貯第30 d達到最大(P<0.05)。青貯結(jié)束后，KM90S組的AA含量顯著高于另外2組(P<0.05)。青貯第7～30 d，KM110S組的LA/AA顯著高于另外2組(P<0.05)。三個試驗組的NH3-N含量隨著青貯時間延長增加(P<0.05)，均在青貯第30 d達到最大，除青貯第3 d外，KM90S組的NH3-N含量高于KM110S和KM130S組。

表2 王草青貯過程中發(fā)酵品質(zhì)的變化Table 2 Changes in the fermentation quality of king grass silage during ensiling

2.3 王草青貯過程中化學成分和營養(yǎng)品質(zhì)的變化

由表3可知，青貯結(jié)束后3組王草的DM含量顯著降低(P<0.05)。WSC含量隨著青貯時間的延長總體呈現(xiàn)為在青貯前7 d迅速下降(P<0.05)，隨后下降速度減緩，均在青貯第30 d達到最低。與青貯第1 d相比，KM90S組的CP含量在青貯第14 d顯著降低(P<0.05)。KM90S組的ADF含量在青貯發(fā)酵期間持續(xù)增加，在青貯第14 d顯著增加(P<0.05)。KM130S組的NDF含量在青貯過程中呈增加趨勢，在青貯第30 d達到最大(P<0.05)，KM110S組的NDF含量在青貯第7 d降低(P<0.05)，隨后在青貯第7～30 d顯著增加(P<0.05)。

表3 王草青貯過程中化學成分和營養(yǎng)品質(zhì)的變化Table 3 Changes in nutritional quality and chemical composition of king grass silage during ensiling

2.4 王草青貯30 d微生物α多樣性分析結(jié)果

微生物α多樣性分析結(jié)果見表4，KM90S，KM110S和KM130S組王草的青貯細菌OTU數(shù)分別為292，283，255個，Shannon和Chao指數(shù)隨著生長天數(shù)的延長呈下降趨勢。

表4 王草青貯30 d微生物α多樣性Table 4 Alpha diversity of microbial community diversity for king grass at 30 d silage

2.5 王草青貯30 d微生物β多樣性分析結(jié)果

青貯30 d后用主成分分析(PCA)對王草青貯樣品進行分析，由圖1可知，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)對結(jié)果差異的貢獻度分別為83.46%和9.95%，不同生長天數(shù)王草青貯30 d后細菌群落的分布和結(jié)構(gòu)存在明顯的分離和差異。

圖1 王草青貯30 d細菌群落PCA分析Fig.1 PCA analysis of the bacterial community of king grass silage at 30 days

2.6 王草青貯30 d微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

圖2從門水平和屬水平揭示了不同生長天數(shù)王草青貯30 d樣品的微生物群落多樣性，厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)總共占到了整個樣品門水平的95%～98%，其中KM110S組Firmicutes的相對豐度占到了44.90%，Proteobacteria的相對豐度占到了53.70%。KM90S和KM130S組Firmicutes的相對豐度分別占到了28.13%和21.96%，Proteobacteria的相對豐度分別占到了68.33%和76.58%。共在屬水平檢測出15種細菌，將各組中平均豐度大于0.1%的菌群制作成物種分布堆疊圖。結(jié)果表明，3組王草青貯后的優(yōu)勢菌屬均為腸桿菌屬(unclassifiedEnterobacteriaceae)，其相對豐度在49.01%～70.03%之間。王草青貯料中相對豐度大于0.1%的乳酸菌屬包括植物乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和魏斯氏屬(Weissella)。KM110S組中相對豐度最高的2種乳酸菌屬為Lactobacillus和Pediococcus，相對豐度分別為28.30%和9.64%，KM90S組的乳酸菌屬主要是Lactobacillus，相對豐度為20.38%，KM130S組中主要乳酸菌屬為Lactobacillus和Lactococcus，相對豐度分別占到了9.94%和9.45%。3組王草青貯30 d后梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)的相對豐度較低，在0.49%～1.20%之間。

圖2 王草青貯30 d門(a)和屬(b)水平微生物群落組成Fig.2 Composition of microbial community of king grass silage at the phylum (a) and genus (b) levels at 30 d

3 討論

3.1 不同生長天數(shù)王草原料特性

一般認為LAB數(shù)量大于105cfu·g-1FM能夠使青貯飼料得到良好保存[15]。此外，在不使用任何添加劑時，青貯原料中至少要含約占DM含量8%～10%以上的WSC才能調(diào)制成功[19]。本試驗中，3組王草的LAB數(shù)量在4.39～4.72 105cfu·g-1FM之間，WSC含量約占DM含量的4%～7%，可能會導致青貯發(fā)酵受限。隨著生長天數(shù)延長，3組王草的DM，ADF和NDF含量增加，而CP含量降低，與Lounglawan等[20]研究相符。ADF和NDF含量的增加表明隨著生長時間延長王草木質(zhì)化程度增加。KM90S，KM110S，KM130S組的WSC含量分別為61.57，40.28和71.67 g·kg-1DM。張英[21]等研究發(fā)現(xiàn)，隨著生長期延長王草的WSC呈上升趨勢。Masuko等[22]研究表明，第2茬牧草比第1茬的WSC含量低?？赡芘c植物不同的生長時期、溫度、水分和光照條件有關[23]。

3.2 不同生長天數(shù)王草青貯過程中發(fā)酵品質(zhì)的變化

青貯結(jié)束后3組王草的DM含量均顯著下降，表明在青貯過程中存在營養(yǎng)物質(zhì)的損失。青貯第1～14 d內(nèi)，3組王草的pH下降速度和LA含量增加速度不同，KM110S組最快，其次為KM130S和KM90組，可能與不同生長期刈割牧草附著LAB的數(shù)量、種類和活性有關。青貯第14～30 d，KM130S和KM110S組的pH和LA含量變化不大，KM90S組的LA含量顯著增加，pH顯著下降，與Zi等[24]結(jié)果相一致。pH是評價青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要參數(shù)，本試驗中，青貯結(jié)束后KM110S組(4.31)的pH低于KM90S(4.47)和KM130S組(5.22)，是因為青貯過程中KM110S組的LA含量更多。有研究表明，AA是熱帶牧草青貯過程中的主要產(chǎn)物[25]，在許多熱帶植物如木薯、雀稗和柱花草等青貯飼料中都得到了相類似的結(jié)果[26-27]。青貯結(jié)束后KM90S，KM110S和KM130S組的LA/AA分別為0.48，1.89和0.72，表明生長90 d和生長130 d的王草青貯發(fā)酵類型趨向于異型發(fā)酵模式。此外，青貯結(jié)束后3組王草的PA含量平均為0.83 g·kg-1DM，與Li等[27]在王草青貯飼料中的檢測到的含量接近。AA和PA具有很強的抗真菌特性，可以有效地抑制青貯飼料中酵母菌的活性并提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性[28-29]。Catchpoole和Henzell[31]認為保存良好的青貯飼料的BA含量應小于2.00 g·kg-1DM。青貯結(jié)束后3組王草的BA含量在2.71～4.80 g·kg-1DM之間，未達到良好青貯飼料的要求，可能是王草原料中DM(143.92～217.11 g·kg-1FM)含量較低，容易引起梭菌發(fā)酵[[32-33]。BA含量與梭狀芽孢桿菌的活性有關，梭狀芽孢桿菌會引起青貯飼料中DM和能量的損失，減少牲畜的飼料攝入量，可能會引起動物健康問題[15,30]。

3.3 不同生長天數(shù)王草青貯過程中化學成分和營養(yǎng)品質(zhì)的變化

青貯飼料的調(diào)制主要是在厭氧條件下LAB利用青貯原料中的WSC和少量的纖維素生成LA迅速降低pH從而抑制有害微生物的繁殖[15]。本試驗中，3組王草的WSC含量在青貯前7 d內(nèi)快速下降，在青貯后期下降速度減慢，與郭剛[34]研究結(jié)果一致。KM90S組的LA含量在青貯的前7 d變化不大，可能是在青貯早期，大部分的WSC被植物的呼吸作用和有害微生物的活動所消耗，導致沒有充足的糖被乳酸菌利用，故LA含量無顯著變化，KM90S組第7 d的丁酸和NH3-N含量顯著高于KM110S組和KM130S組也印證這一推測。3組王草的NH3-N含量在青貯過程中顯著增加，這可能是植物蛋白酶和微生物共同作用的結(jié)果[35]。青貯結(jié)束后KM90S組的NH3-N含量最高，同時CP含量降低幅度最大，可能是該組中植物蛋白酶和微生物的活性較高。牧草中重要的營養(yǎng)物質(zhì)包括NDF和ADF，家畜的飼料采食量和消化率與其含量密切相關。與青貯第1 d相比，KM90S組的ADF含量在青貯第14 d顯著增加。KM110S組的NDF含量呈先降后增趨勢，在青貯第7 d達到最低，KM130S組的NDF含量在青貯過程中持續(xù)增加，在青貯第30 d達到最大。青貯過程中ADF和NDF含量的增加可能與DM和WSC等有機物質(zhì)的消耗損失有關，造成ADF和NDF的相對含量增加[36-37]。

3.4 不同生長天數(shù)王草的微生物多樣性

青貯飼料的品質(zhì)主要取決于發(fā)酵過程中微生物群落及其代謝產(chǎn)物，因此，研究青貯飼料中的微生物群落組成可以為提高青貯發(fā)酵質(zhì)量提供有價值的科學依據(jù)[38]。本試驗所有樣本的覆蓋率(Coverage)均在99%以上，表明測序數(shù)據(jù)有足夠的覆蓋性，可以反映細菌群落的核心組成。Shannon指數(shù)為常用的物種多樣性指數(shù)，Shannon指數(shù)越大表明樣品中物種多樣性越高，Chao指數(shù)越高，表明樣品中物種豐度越高[39]。本試驗中，Shannon和Chao指數(shù)隨著王草生長天數(shù)的延長呈下降趨勢，說明隨著生長期延長，王草青貯飼料的微生物多樣性有所降低。在主成分分析中(圖1)，每個點距離越近代表樣品之間微生物群落相似度越高，距離越遠代表樣品之間微生物群落相似度越低。3組王草青貯樣品能夠較明顯的區(qū)分開。說明不同生長天數(shù)王草青貯微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)存在一定的差異。

3組王草青貯飼料在門水平上細菌區(qū)系的兩大優(yōu)勢菌為Proteobacteria(53.7%～76.58%)和Firmicutes(28.13%～44.9%)，與Zhang等[40]研究結(jié)果一致。青貯中參與LA發(fā)酵的大部分細菌群落屬于Firmicutes，例如Lactobacillus，Pediococcus，Lactococcus，Weissella和Leuconostoc。本試驗中KM110S組Firmicutes的相對豐度分別比KM90S和KM130S組高59.31%和104.30%，這可能是KM110S組中pH相對較低的原因，與Keshri等[41]在低pH青貯飼料中觀察到的Firmicutes相對豐度較高的結(jié)果一致。青貯飼料中的LAB可以發(fā)酵WSC產(chǎn)酸降低pH，從而抑制有害微生物的活性，使青貯飼料得到良好保存。一般認為青貯發(fā)酵初期飼料中主要的LAB屬為Enterococcus，Lactococcus，Pediococcus和Leuconostoc，之后隨著青貯飼料pH的下降，逐漸被產(chǎn)酸能力強的Lactobacillus替代[15]。本試驗中，KM90S和KM110S組在屬水平上優(yōu)勢LAB均為Lactobacillus，相對豐度分別為20.38%和28.30%，KM130S組中優(yōu)勢LAB為Lactobacillus和Lactococcus，相對豐度分別為9.94%和9.45%。這可能跟KM130S組青貯結(jié)束后較高的pH(5.22)有關。盧強等[42]研究發(fā)現(xiàn)，在pH(5.08～5.41)較高的苜蓿青貯料中，Lactobacillus，Lactococcus和Enterococcus的相對豐度較高。

青貯飼料中的腸桿菌可能與LAB競爭營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生NH3-N并造成營養(yǎng)損失[43]。本試驗中，3組王草青貯飼料在屬水平上的優(yōu)勢菌為unclassifiedEnterobacteriaceae(49.01%～70.03%)，與Li等[26]研究結(jié)論相一致。青貯飼料中BA的積累主要由梭菌發(fā)酵引起，不僅降低青貯飼料的營養(yǎng)價值，而且危害人和動物的健康[44]。王草青貯30 d后Clostridium(0.49%～1.20%)的相對豐度較低。表明3組王草青貯過程中BA的產(chǎn)生可能與青貯早期Clostridium的活動有關，隨著青貯時間的延長，3組王草青貯的pH下降，Clostridium的活性受到抑制。

4 結(jié)論

與生長90 d和130 d的王草相比，生長110 d王草青貯結(jié)束后的pH，NH3-N和BA含量最低，乳酸菌屬相對豐度和LA含量最高，因此生長110 d的王草調(diào)制出的青貯飼料優(yōu)于生長90 d和130 d的。