張海娟， 蘆光新*， 范月君， 周華坤， 周學(xué)麗， 竇聲云， 姚世庭， 顏琿璘，趙陽安， 馬坤， 祁巖慧， 邱鵬瀅

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院， 青海 西寧 810016； 2.中國科學(xué)院西北高原生物研究所， 青海省寒區(qū)恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008； 3.青海農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院， 青海 湟源 812100； 4.青海省草原改良試驗(yàn)站， 青海 共和 813000)

高寒草地是青藏高原最主要的生態(tài)系統(tǒng)，總面積約為1.4億hm2，占青藏高原面積的53%左右[1-2]，具有支撐草牧業(yè)發(fā)展、調(diào)節(jié)區(qū)域氣候和維護(hù)生物多樣性等生態(tài)功能[3-4]。但在全球氣候變化和人類活動(dòng)的共同驅(qū)動(dòng)下，高寒草地面臨著嚴(yán)重退化問題。為此，國家采取了圍欄封育、補(bǔ)播、施肥和建植人工草地等一系列恢復(fù)改良措施[5-6]，取得了一定的成效。在退化高寒草地適應(yīng)性管理的情勢下，人工補(bǔ)播結(jié)合土壤微生物調(diào)控等輔助措施是當(dāng)前退化高寒草地生態(tài)恢復(fù)的關(guān)鍵手段[1]。

‘川草2號’老芒麥(Elymussibiricus‘Chuancao No.2’)和‘阿壩’垂穗披堿草(Elymusnutans‘Aba’)2種多年生禾本科牧草因具高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗寒、耐貧瘠等特點(diǎn)，是當(dāng)前應(yīng)用于高寒草地的主要播種植物[7-9]，但在高寒地區(qū)極端的環(huán)境條件下，生長極易受限。叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌是土壤中普遍存在的一種共生微生物，研究表明，它能與禾本科、豆科和莎草科等80%以上的陸生高等植物及大部分水生、半水生植物建立互惠共生關(guān)系[10-12]，從宿主植物處獲得碳源，供自身生長和繁殖，同時(shí)，為植物提供氮和磷等礦質(zhì)養(yǎng)分[13-14]。因此，利用AM真菌促進(jìn)多年生禾本科牧草在極端環(huán)境的生長對退化高寒草地生態(tài)修復(fù)具有十分重要的意義。

目前有關(guān)AM真菌促進(jìn)禾本科牧草生長的研究已有很多，但多以盆栽接種試驗(yàn)為主[15-20]，鮮見其促進(jìn)禾本科牧草在高寒草地等自然生境中生長的研究。鑒于此，本文通過盆栽與大田相結(jié)合的試驗(yàn)方法，研究了根內(nèi)球囊霉(Glomusintraradices，GI)和摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草生長的影響，以期為植物微生物聯(lián)合生態(tài)修復(fù)技術(shù)在退化高寒草地恢復(fù)治理中的應(yīng)用提供技術(shù)指導(dǎo)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草購自四川省草原科學(xué)研究院。種子播種前，用10%H2O2消毒10 min，無菌水沖洗5次，濾紙吸干水分后使用。供試AM真菌為根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉，通過白三葉草(Trifoliumrepens)擴(kuò)繁篩選后使用。栽培基質(zhì)為青海省草原改良試驗(yàn)站的田間土，養(yǎng)分含量為：總氮1 469.56 mg·kg-1，氨態(tài)氮21.89 mg·kg-1，硝態(tài)氮64.98 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)4.07%?；|(zhì)晾干后過2 mm土壤篩，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌2 h后使用。培養(yǎng)盆缽為規(guī)格18 cm × 15 cm×13 cm(上口徑×下口徑×高)的塑料花盆，用75%的酒精反復(fù)擦拭消毒后使用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1盆栽試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)置接種根內(nèi)球囊霉(GI)、接種摩西球囊霉(GM)和不接種(Control check，CK)3個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，2種牧草各9盆，共有18盆，隨機(jī)排列，隔天調(diào)換位置。每盆裝培養(yǎng)基質(zhì)500 g，供試AM真菌菌劑20 g[21-22]，牧草種子播量均為50?！づ?1，出苗7 d后定苗至30株·盆-1。試驗(yàn)在青海大學(xué)農(nóng)牧實(shí)驗(yàn)樓草地微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)為22℃/20℃(D/N，16/8 h)，濕度均為60%，光照為52 000/0 lx(D/N，16/8 h)。栽培周期為2個(gè)月(2021年6月9日至2021年8月9日)，栽培期間每周澆1次Hoagland營養(yǎng)液[23-25]，每次每盆100 mL。

1.2.2大田試驗(yàn) 2021年6月3日，在青海省草原改良試驗(yàn)站項(xiàng)目試驗(yàn)地的試驗(yàn)小區(qū)(小區(qū)建于2020年5月，面積均為3 m × 5 m，條播，每個(gè)小區(qū)10條，圖1)單播種植2種多年生禾本科牧草‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草，隨機(jī)選擇有機(jī)肥(有機(jī)質(zhì)含量≥ 45%，N + P2O5+ K2O ≥ 5%，購自蒲江縣綠地秸稈科技有限公司)施用量分別為0(L1，P1)和5.25 t·hm-2(L4，P4)的4個(gè)試驗(yàn)小區(qū)進(jìn)行AM真菌接種試驗(yàn)。具體接種方法為：于每個(gè)小區(qū)中間4行隨機(jī)選擇9條長勢基本一致的30 cm的牧草樣帶(每個(gè)處理各3段)，清除周圍雜草石粒后，用75%酒精反復(fù)擦拭消毒的鏟子挖開樣帶根圍的土壤，深度為10 cm，取適量根樣裝在自封袋里帶回實(shí)驗(yàn)室檢測土著菌根侵染情況，然后用消毒處理的塑料隔斷將樣段周圍圍起(深度15 cm)，均勻撒上供試AM真菌菌劑后覆原土，菌劑劑量均為300 g，在大田下生長3個(gè)月后檢測菌根形成情況和菌根侵染率及牧草生長狀況。

圖1 野外試驗(yàn)小區(qū)布置圖Fig.1 Layout of test plot in the field

1.3 取樣及測定

1.3.1菌根侵染率 每個(gè)處理隨機(jī)取15株完整的植物根系，洗凈后用甲醛-乙酸-乙醇固定液(Formaldehyde acetic acid，F(xiàn)AA)固定過夜，次日采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測菌根結(jié)構(gòu)[25]，并按Biermann等的方法計(jì)算菌根侵染率[26]。

1.3.2牧草生長指標(biāo) 盆栽試驗(yàn)結(jié)束后，用直尺測定植物株高，每個(gè)處理隨機(jī)測定10株，3次重復(fù)；隨機(jī)取5株健康植株，表面清洗干凈后用濾紙擦干，分別測定單株地上和地下生物量，每個(gè)處理重復(fù)3次。大田接種試驗(yàn)結(jié)束后，分別測定植物株高、葉片數(shù)、穗長、節(jié)數(shù)和出土第2節(jié)直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)；同時(shí)，取適量植物根系測定菌根侵染率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件整理數(shù)據(jù)并作圖，IBM SPSS 26.0軟件做單因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan法做多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種AM真菌對2種盆栽多年生禾本科牧草菌根形成及侵染率的影響

GI和GM均能侵染‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的根系形成菌絲和泡囊等菌根結(jié)構(gòu)(圖2)。GI或GM對2種多年生禾本科牧草的菌根侵染率無顯著差異。2種AM真菌對2種禾本科牧草的菌根侵染率均為GI組顯著高于GM組和CK組(P< 0.05)，GI對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的侵染率分別是GM的1.21倍和1.36倍(表1)。

圖2 2種盆栽禾本科牧草根系菌根形成情況Fig.2 Mycorrhizal formation of two potted gramineous herbages注：L代表‘川草2號’老芒麥；P代表‘阿壩’垂穗披堿草；a,b,c分別代表不接種、接種根內(nèi)球囊霉和接種摩西球囊霉Note:L indicates Elymus sibiricus ‘Chuancao No.2’;P indicates Elymus nutans ‘Aba’;a,b,c indicate no inoculation,inoculation with Glomus intraradices,and inoculation with Glomus mosseae

表1 接種AM真菌對2種盆栽禾本科牧草菌根侵染率的影響Table 1 Effects on mycorrhizal infection rate of two potted gramineae herbages of AM fungi

2.2 接種AM真菌對2種盆栽禾本科牧草生長的影響

接種GI和GM 2個(gè)月后，‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的株高與不接種的CK處理相比無顯著差異。接種GM的‘阿壩’垂穗披堿草的地上生物量和‘川草2號’老芒麥的地下生物量顯著高于GI組和CK組(P< 0.05)(圖3)。

圖3 接種AM真菌對2種盆栽多年生禾本科牧草株高和生物量的影響Fig.3 Effects on height and aboveground and underground biomass of two potted gramineae herbages of AM fungi

2.3 大田下2種禾本科牧草根系土著菌根形成及侵染情況

‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草單播種植1年后，根系均受土著AM真菌侵染，施有機(jī)肥(L4，P4)增加了孢子和菌絲等菌根結(jié)構(gòu)。方差分析結(jié)果表明，‘阿壩’垂穗披堿草的土著菌根侵染率顯著高于‘川草2號’老芒麥(P< 0.05)，施有機(jī)肥(L4,P4)的土著菌根侵染率顯著高于不施肥的CK處理(L1，P1)(P< 0.05)(圖4)。

圖4 大田下2種禾本科牧草根系土著菌根形成情況及菌根侵染率Fig.4 Mycorrhizal formation and infection rate of two gramineae herbages of indigenous mycorrhizal in the field注：L1，P1和OR-代表不施有機(jī)肥；L4，P4和OR+代表有機(jī)肥施量為5.25 t·hm-2。下同Note:L1,P1 and OR- indicate organic fertilizer rate is 0;L4,P4 and OR+ indicate organic fertilizer rate is 5.25 t·hm-2. The same as below

2.4 接種AM真菌對2種大田禾本科牧草菌根形成及侵染率的影響

大田下接種GI和GM 3個(gè)月后，‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系的泡囊等菌根結(jié)構(gòu)明顯多于不接種的CK處理(圖5)，施有機(jī)肥(L4，P4)顯著增加了‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系的菌根結(jié)構(gòu)，菌根形態(tài)從6月份的孢子結(jié)構(gòu)為主，變?yōu)橐耘菽医Y(jié)構(gòu)為主。菌根侵染率分析結(jié)果表明，GI和GM對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率均顯著高于CK處理(P<0.05)，GI組的菌根侵染率均顯著高于GM組，施肥處理組顯著高于不施肥處理組(P<0.05)。

圖5 大田下接種AM真菌對2種禾本科牧草根系菌根形成及侵染率的影響Fig.5 Effect on mycorrhizal formation and infection rate of two gramineae herbages inoculated with AM fungi in the field

2.5 接種AM真菌對2種大田禾本科牧草生長的影響

大田下接種GI和GM 3個(gè)月后，‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的生長與不接種的CK處理相比有所差異(表2)。經(jīng)分析，在不施有機(jī)肥(L1，P1)時(shí)，GM組的‘川草2號’老芒麥的株高顯著低于GI組和CK組(P<0.05)，GI和GM組的穗長顯著低于CK(P<0.05)，GM組的出土第2節(jié)直徑顯著低于CK組(P<0.05)，葉片數(shù)和節(jié)數(shù)在GI，GM和CK組間均無顯著差異；‘阿壩’垂穗披堿草的各項(xiàng)生長指標(biāo)在GI，GM和CK組間均無顯著差異；在施有機(jī)肥時(shí)(L4，P4)，GI組的‘川草2號’老芒麥的株高顯著低于GM組和CK組(P<0.05)，GM組的葉片數(shù)顯著高于GI組和CK組(P<0.05)，穗長、節(jié)數(shù)和出土第2節(jié)直徑在GM，GM和CK組間無顯著差異；GI組和GM組的‘阿壩’垂穗披堿草的株高和穗長均顯著低于CK組(P<0.05)，其余指標(biāo)在不同接種處理間均無顯著差異。

表2 大田環(huán)境下接種AM真菌對2種禾本科牧草生長的影響Table 2 Effect on growth of two gramineae herbages inoculated with AM fungi in the field

3 討論

3.1 栽培條件對AM真菌促生效果的影響

AM真菌侵入寄主植物根系皮層細(xì)胞形成菌根后，能擴(kuò)大寄主植物在土壤中的有效吸收范圍，加強(qiáng)植物對根際以外的水分和礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收[27]，進(jìn)而促進(jìn)牧草生長。本研究在控制溫度和水分等盆栽條件下對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草分別接種GI和GM后，2種多年生禾本科牧草的地上生物量均不同程度增加。然而，在大田環(huán)境下，對2種多年生禾本科牧草接種GI和GM后，‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的生長情況與CK相比無顯著差異。這可能是因?yàn)橥寥乐形⑸锓N類繁多，它們與AM真菌之間存在復(fù)雜的種間關(guān)系，其中不乏抑制AM真菌生長的菌種，進(jìn)而影響了植物生長。同時(shí)，大田環(huán)境下不可控因素過多，如溫度、光照和水分等，也會(huì)影響AM真菌促生功能的正常發(fā)揮[28]。其他研究者也做了相似研究，得出的結(jié)論也有所差異。如高亞敏等對燕麥(Avenasativa)接種從祁連山退化高寒草地優(yōu)勢種植物鈍裂委陵菜(Potentillachinensis)根圍分離出的AM真菌后，燕麥幼苗的株高、莖粗和葉綠素b含量等增加[20]，這與本研究結(jié)果一致。王新軍等通過盆栽和野外相結(jié)合的試驗(yàn)研究了摩西球囊霉等3種AM真菌對青藏高原路域星星草(Puccinelliatenuiflora)生長的影響，結(jié)果顯示盆栽接種AM真菌能顯著增加星星草的株高和生物量，野外接種AM真菌同樣也顯著增加了植被株高和覆蓋度[29]。這與本研究結(jié)果不同，可能是由研究對象、接種時(shí)間和接種方法等不同所致。曹麗霞等對退化羊草(Leymuschinensis)草原接種土著AM真菌后發(fā)現(xiàn)，植物群落的高度、蓋度、地上生物量和物種豐富度增加[30]。這可能是由供試AM真菌不同引起，土著AM真菌具有一定的環(huán)境適應(yīng)性，更容易在高海拔極端環(huán)境下生存，而AM真菌的最適生長溫度在15℃以上[31]，外源AM真菌適應(yīng)高寒冷涼環(huán)境需要較高的能量支撐。錢潔鑫以未退化草場5～20 cm土層的根土混合樣為菌根接種源對內(nèi)蒙古錫林郭勒盟嚴(yán)重退化草原地段人工接種AM菌根后補(bǔ)播羊草，結(jié)果羊草蓋度增加了3.3倍，地上部生物量增加了1.6倍[32]，這可能是因?yàn)榻臃N源和接種方法等不同導(dǎo)致。然而，石偉琦通過原位試驗(yàn)對內(nèi)蒙古草原大針茅(Stipagrandis)群落接種AM真菌后，短期內(nèi)植物群落的物種豐富度、多樣性、植物群落的結(jié)構(gòu)和凈初級生產(chǎn)力均未發(fā)生顯著變化[33]。蔡曉布等采用草地均勻打孔法，研究了接種AM真菌對長芒草(stipabungeana)的侵染效應(yīng)及對其生長的影響，結(jié)果表明，接種處理根圍土壤AM真菌孢子密度和菌根侵染率等顯著提高，對植株地上部生長無顯著影響[34]。本研究也得出與上述相似的結(jié)論，即接種AM真菌對植物生長無顯著影響，卻能顯著提高菌根侵染率。這可能是因?yàn)橥饨绛h(huán)境因素干擾較大，AM真菌需要消耗更多能量來適應(yīng)環(huán)境，供給寄主植物的能量較少所致。

3.2 施肥對菌根侵染率的影響

本研究結(jié)果顯示施有機(jī)肥的地塊，‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系的土著菌根侵染率顯著高于不施肥處理，外源接種AM真菌后，施有機(jī)肥處理的菌根侵染率亦顯著高于不施肥的對照處理，表明施有機(jī)肥能促進(jìn)AM真菌對禾本科牧草的侵染。原因可能是施有機(jī)肥增加了土壤中氮磷等養(yǎng)分含量[35]，激發(fā)了土壤中AM真菌的活性[36]，促使其為宿主植物提供更多的礦質(zhì)能量[37]，也有可能是因?yàn)槭┯袡C(jī)肥引入了新的微生物菌種，影響了AM真菌的群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響了AM真菌對禾本科牧草的侵染[38]。

4 結(jié)論

大田環(huán)境下根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉均能成功侵染高寒草地多年生禾本科牧草‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系，施有機(jī)肥能增強(qiáng)接種叢枝菌根真菌的菌根侵染率，但在短期內(nèi)對多年生禾本科牧草生長無顯著影響。因此，以后可以結(jié)合施肥等田間管理措施開展叢枝菌根真菌接種效應(yīng)研究，增加叢枝菌根真菌應(yīng)用于退化草地生態(tài)修復(fù)等領(lǐng)域中的可能。