李紅玉, 王雅聰, 曾 佳, 王聰聰, 董寬虎, 夏方山*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科研管理部， 山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 山西 太谷 030801；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 北京 100193)

種子是現(xiàn)代農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)過程中最重要的基礎(chǔ)性資料，其質(zhì)量好壞是決定農(nóng)牧業(yè)發(fā)展質(zhì)量高低的關(guān)鍵所在[1-2]。種子活力會(huì)在發(fā)育成熟后的貯藏過程中不斷喪失，而活性氧(Reactive oxygen species，ROS)過量累積被認(rèn)為是種子活力喪失的主要原因[3]，H2O2是動(dòng)植物體內(nèi)調(diào)控ROS平衡的動(dòng)態(tài)核心，其含量升高被認(rèn)為是直接導(dǎo)致種子活力喪失的決定因素[4-5]。然而，H2O2又是一種參與植物調(diào)節(jié)生長發(fā)育的小分子信號(hào)物質(zhì)，其具有維持植物細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用，能夠促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗根系生長，并提高植物抗逆生長能力[6]。研究發(fā)現(xiàn)，H2O2的生理生化作用具有濃度效應(yīng)，低濃度會(huì)發(fā)揮促進(jìn)作用，而高濃度則會(huì)起抑制作用[7-9]，此外，外源H2O2處理對(duì)植物種子萌發(fā)及幼苗生長的影響與植物種類(品種)及引發(fā)時(shí)間關(guān)系密切，且其作用機(jī)理目前仍不明確[10]。研究燕麥(Avenasativa)種子老化發(fā)現(xiàn)，H2O2含量升高是導(dǎo)致其活力降低的主要原因，這主要是由種胚細(xì)胞及線粒體內(nèi)抗壞血酸-谷胱甘肽(Ascorbic acid-glutathione，AsA-GSH)循環(huán)抗氧化能力降低而導(dǎo)致了脂質(zhì)過氧化損傷加劇造成的[10-13]。高濃度外源H2O2長時(shí)間處理也會(huì)造成燕麥種子活力的喪失[9]，且外源H2O2處理對(duì)種子抗氧化酶的影響雖已在植物萌發(fā)及其幼苗抗鹽堿[6-7]及抗寒[8]等方面有了報(bào)道，但關(guān)于內(nèi)外源H2O2影響種子胚細(xì)胞AsA-GSH循環(huán)的異同關(guān)系仍未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以燕麥種子為材料，探討外源H2O2對(duì)其ASA-GSH循環(huán)抗氧化酶活性的影響，以期驗(yàn)證H2O2調(diào)節(jié)種子活力的抗氧化機(jī)理，從而為詳細(xì)闡明H2O2影響種子老化的內(nèi)在機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試種子為‘太陽神’燕麥，于2018年3月購買自北京正道農(nóng)業(yè)股份有限公司，種子初始發(fā)芽率為98%左右，初始含水量為7.8%(鮮重基礎(chǔ))左右，-20℃條件保存至2018年5月試驗(yàn)進(jìn)行。

1.2 H2O2引發(fā)處理

參照文獻(xiàn)[14]的方法將燕麥種子含水量調(diào)整至10%(鮮重基礎(chǔ))左右，將每份約10 g左右燕麥種子在室溫黑暗條件下分別用200 mL不同濃度(0，0.96，1.92，3.84和7.68 mol·L-1)的H2O2浸泡0，6，12和18 h，再用蒸餾水沖洗3次并用濾紙吸干表面水分，最后置于黑暗室溫條件下干燥2 d，使其含水量降至約10%左右(鮮重基礎(chǔ))，于4℃下密封保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 指標(biāo)測定

粗酶液的提取參考Kibinza等[15]的方法進(jìn)行，在室溫條件下用蒸餾水吸脹4 h(胚根為突破種皮)后剝?nèi)?00個(gè)種胚冰浴研磨，每個(gè)處理重復(fù)4次。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)的活性測定參照Rao和Sresty[16]的方法，過氧化氫酶(Catalase，CAT)的活性測定參照Clairbone[17]的方法，谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)的活性測定參照Esterbauer和Grill[18]的方法，抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)和脫氫抗壞血酸還原酶(Dehydroascorbate reductase，DHAR)的活性測定參照Nakano和Asada[19]的方法，單脫氫抗壞血酸還原酶(Monodehydroasorbate reductase，MDHAR)的活性測定參照Arrigoni等[20]的方法，H2O2和可溶性蛋白含量測定均使用購買自南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量測定則參照Bailly等[21]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和方差分析，之后用Duncans法(P<0.05)進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源H2O2引發(fā)對(duì)燕麥種胚細(xì)胞SOD活性的影響

由圖1可知，引發(fā)6 h時(shí)，燕麥種胚細(xì)胞SOD活性隨H2O2濃度增加而升高，濃度0.96～ 7.68 mol·L-1間均差異顯著(P<0.05)；引發(fā)12和18 h時(shí)，其SOD活性隨H2O2濃度增加呈先升后降的趨勢，且各濃度間均存在顯著差異(P<0.05)，分別在1.92和0.96 mol·L-1時(shí)達(dá)到最大值。濃度為0.96 mol·L-1時(shí)，其SOD活性隨引發(fā)時(shí)間延長呈顯著升高趨勢(P<0.05)；濃度為1.92～7.68 mol·L-1時(shí)，其SOD活性隨引發(fā)時(shí)間延長呈先升后降趨勢，各引發(fā)時(shí)間下均顯著高于CK(P<0.05)，濃度為1.92，3.84和7.68 mol·L-1時(shí)分別在引發(fā)12，6和6 h達(dá)到最大值。

圖1 外源H2O2引發(fā)下燕麥種胚細(xì)胞SOD活性變化Fig.1 Changes of SOD activities in embryonic cells of oat seeds under exogenous H2O2 priming注：不同大寫字母表示同一引發(fā)時(shí)間下不同濃度間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一濃度下不同引發(fā)時(shí)間間差異顯著(P<0.05)，下圖同Note:Means with different capital letters are significant differences between different concentrations under same priming time at the 0.05 level；means with different small letters are significant differences between different priming time under same concentrations at the 0.05 level, the same as below

2.2 外源H2O2引發(fā)對(duì)燕麥種胚細(xì)胞CAT活性的影響

由圖2可知，引發(fā)6～18 h時(shí)，燕麥種胚細(xì)胞CAT活性均隨H2O2濃度增加呈先升后降的趨勢；引發(fā)6 h時(shí)其在1.92和3.84 mol·L-1顯著高于其他濃度(P<0.05)，而引發(fā)12和18 h時(shí)則均在0.96 mol·L-1顯著高于其他濃度(P<0.05)。濃度為0和0.96 mol·L-1時(shí)，燕麥種胚細(xì)胞CAT活性隨引發(fā)時(shí)間延長而顯著升高(P<0.05)；濃度為1.92～7.68 mol·L-1時(shí)，其CAT活性均隨引發(fā)時(shí)間延長呈先升后降趨勢，并在引發(fā)6 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05)，且同一H2O2濃度下各引發(fā)時(shí)間存在顯著差異(P<0.05)，且均顯著高于CK(P<0.05)。

圖2 外源H2O2引發(fā)下燕麥種胚細(xì)胞CAT活性變化Fig.2 Changes of CAT activities in embryonic cells of oat seeds under exogenous H2O2 priming

2.3 外源H2O2引發(fā)對(duì)燕麥種胚細(xì)胞APX活性的影響

由圖3所示，引發(fā)6～18 h時(shí)，燕麥種胚細(xì)胞APX活性均隨H2O2濃度增加呈先升后降的趨勢，且均在0.96 mol·L-1時(shí)顯著高于其他濃度(P<0.05)；引發(fā)6 h時(shí)，其在7.68 mol·L-1時(shí)顯著低于0 mol·L-1時(shí)(P<0.05)；引發(fā)12 h時(shí)，其在3.84和7.68 mol·L-1時(shí)顯著低于0 mol·L-1時(shí)(P<0.05)；引發(fā)18 h時(shí)，其在1.92～7.68 mol·L-1時(shí)均顯著低于0 mol·L-1時(shí)(P<0.05)。濃度為0～3.84 mol·L-1時(shí)，燕麥種胚細(xì)胞APX活性隨引發(fā)時(shí)間延長呈先升后降趨勢；濃度為0.96 mol·L-1時(shí)其APX活性在各引發(fā)時(shí)間下均顯著高于CK(P<0.05)，并在引發(fā)6 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05)；濃度為1.92 mol·L-1時(shí)其APX活性在引發(fā)6和12 h時(shí)顯著高于CK(P<0.05)；濃度為3.84 mol·L-1時(shí)其APX活性在引發(fā)6 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05)，但在引發(fā)12和18 h時(shí)顯著低于CK(P<0.05)；濃度為7.68 mol·L-1時(shí)，其APX活性隨引發(fā)時(shí)間的延長而顯著下降(P<0.05)。

圖3 外源H2O2引發(fā)下燕麥種胚細(xì)胞APX活性變化Fig.3 Changes of APX activities in embryonic cells of oat seeds under exogenous H2O2 priming

2.4 外源H2O2引發(fā)對(duì)燕麥種胚細(xì)胞MDHAR活性的影響

由圖4所示，引發(fā)6～18 h時(shí)，燕麥種胚細(xì)胞MDHAR活性均隨H2O2濃度增加呈先升后降的趨勢，且各濃度間存在顯著差異(P<0.05)；引發(fā)6 h時(shí)，其MDHAR活性在0.96～3.84 mol·L-1時(shí)顯著高于0 mol·L-1時(shí)(P<0.05)，并在1.92 mol·L-1時(shí)達(dá)到最大值，而在7.68 mol·L-1時(shí)則顯著低于0 mol·L-1時(shí)(P<0.05)；引發(fā)12和18 h時(shí)其MDHAR活性在0.96和1.92 mol·L-1時(shí)顯著高于0 mol·L-1時(shí)(P<0.05)，并均在0.96 mol·L-1時(shí)達(dá)到最大值，而在3.84和7.68 mol·L-1時(shí)則顯著低于0 mol·L-1時(shí)(P<0.05)。除濃度為0 mol·L-1外，同一H2O2濃度下各引發(fā)時(shí)間下存在顯著差異(P<0.05)；0.96～3.84 mol·L-1時(shí)，其MDHAR活性隨引發(fā)時(shí)間延長呈先升后降趨勢；在0.96和1.92 mol·L-1時(shí)，各引發(fā)時(shí)間下均顯著高于CK(P<0.05)，并分別在引發(fā)12和6 h時(shí)達(dá)到最大值；在3.84 mol·L-1時(shí)，其MDHAR活性在引發(fā)6 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05)，但在引發(fā)12和18 h時(shí)顯著低于CK(P<0.05)；在7.68 mol·L-1時(shí)，其MDHAR活性則隨引發(fā)時(shí)間延長而顯著下降(P<0.05)。

圖4 外源H2O2引發(fā)下燕麥種胚細(xì)胞MDHAR活性變化Fig.4 Changes of MDHAR activities in embryonic cells of oat seeds under exogenous H2O2 priming

2.5 外源H2O2引發(fā)對(duì)燕麥種胚細(xì)胞DHAR活性的影響

由圖5可知，引發(fā)6～18 h時(shí)，燕麥種胚細(xì)胞DHAR活性均隨H2O2濃度增加呈先升后降的趨勢；引發(fā)6和12 h時(shí)，其DHAR活性均在0.96和1.92 mol·L-1時(shí)顯著高于0 mol·L-1時(shí)(P<0.05)，而引發(fā)18 h時(shí)僅在0.96 mol·L-1時(shí)顯著高于其他濃度(P<0.05)；引發(fā)6 h時(shí)其DHAR活性僅在7.68 mol·L-1時(shí)顯著低于0 mol·L-1時(shí)(P<0.05)，而引發(fā)12和18 h時(shí)則在3.84和7.68 mol·L-1時(shí)均顯著低于0 mol·L-1時(shí)(P<0.05)。濃度為0.96～3.84 mol·L-1時(shí)，其DHAR活性隨引發(fā)時(shí)間延長呈先升后降趨勢；濃度為0.96 mol·L-1時(shí)，其DHAR活性在各引發(fā)時(shí)間均顯著高于CK(P<0.05)，并在引發(fā)12 h時(shí)達(dá)到最大值；濃度為1.92和3.84 mol·L-1時(shí)，其DHAR活性均在引發(fā)6 h時(shí)顯著高于其他引發(fā)時(shí)間(P<0.05)，但濃度為3.84 mol·L-1時(shí)則在引發(fā)12和18 h時(shí)顯著低于CK(P<0.05)；濃度為7.68 mol·L-1時(shí)，其DHAR活性隨引發(fā)時(shí)間延長而顯著下降(P<0.05)。

圖5 外源H2O2引發(fā)對(duì)燕麥種胚細(xì)胞DHAR活性變化Fig.5 Changes of DHAR activities in embryonic cells of oat seeds under exogenous H2O2 priming

2.6 外源H2O2引發(fā)對(duì)燕麥種胚細(xì)胞GR活性的影響

由圖6所示，引發(fā)6～18 h時(shí)，燕麥種胚細(xì)胞GR活性均隨H2O2濃度增加呈先升后降的趨勢，且0.96～7.68 mol·L-1時(shí)均顯著高于0 mol·L-1時(shí)(P<0.05)；引發(fā)6 h時(shí)，其GR活性在1.92和3.84 mol·L-1時(shí)顯著高于其他濃度(P<0.05)；引發(fā)12和18 h時(shí)，其GR活性各濃度間存在顯著差異(P<0.05)，分別在1.92和0.96 mol·L-1時(shí)達(dá)到最大值。濃度為0.96 mol·L-1時(shí)，其GR活性隨引發(fā)時(shí)間延長而顯著升高(P<0.05)；濃度為1.92～7.68 mol·L-1時(shí)，其GR活性隨引發(fā)時(shí)間延長呈先升后降趨勢，但在各引發(fā)時(shí)間下均顯著高于CK(P<0.05)。

圖6 外源H2O2引發(fā)下燕麥種胚細(xì)胞GR活性變化Fig.6 Changes of GR activities in embryonic cells of oat seeds under exogenous H2O2 priming

2.7 外源H2O2引發(fā)對(duì)燕麥種胚細(xì)胞H2O2和MDA含量的影響

由圖7可知，引發(fā)6～18 h時(shí)，燕麥種胚細(xì)胞H2O2和MDA含量均隨H2O2濃度增加而升高，且均在7.68 mol·L-1時(shí)達(dá)到最大值，并顯著高于其他濃度(P<0.05)；除濃度為0和0.96 mol·L-1時(shí)，其MDA含量無顯著差異外，其H2O2和MDA含量在各濃度間均存在顯著差異(P<0.05)。燕麥種胚細(xì)胞H2O2和MDA含量在0.96～7.68 mol·L-1時(shí)均隨引發(fā)時(shí)間延長而升高，且均顯著高于CK(P<0.05)；濃度為1.92～7.68 mol·L-1時(shí)，其H2O2和MDA含量在同一濃度下的各引發(fā)時(shí)間間均存在顯著差異(P<0.05)。

圖7 外源H2O2引發(fā)下燕麥種胚細(xì)胞H2O2(A)和MDA(B)含量變化Fig.7 Changes of H2O2 (A) and MDA (B) contents in embryonic cells of oat seeds under exogenous H2O2 priming

3 討論

植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除在正常條件下會(huì)處于一個(gè)維持正常生命活動(dòng)的動(dòng)態(tài)平衡，然而這種平衡一旦被破壞就會(huì)影響植物的正常代謝活動(dòng)，從而破壞其正常的生長發(fā)育[22]。抗氧化酶是動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)調(diào)控ROS自由基平衡的主要清除劑，可緩解植物種子老化過程中過量積累的ROS對(duì)其細(xì)胞膜的攻擊作用，減弱其細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而降低植物種子的老化速率[23]。然而，種子細(xì)胞在老化過程中會(huì)大量積累以H2O2為動(dòng)態(tài)核心的ROS自由基，并造成其抗氧化酶活性的迅速下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，使種子活力逐漸喪失[24]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源H2O2引發(fā)濃度為0～0.96 mol·L-1時(shí)燕麥種胚細(xì)胞內(nèi)H2O2含量增加相對(duì)緩慢，而其SOD，CAT，APX，MDHAR，DHAR及GR活性均保持較高水平，其MDA含量增加也就相對(duì)較少，這表明此時(shí)燕麥種胚細(xì)胞內(nèi)AsA-GSH循環(huán)有能力清除過量增加的H2O2，從而減緩其造成的脂質(zhì)過氧化損傷。因此，燕麥種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及幼苗活力指數(shù)在外源H2O2引發(fā)濃度為0～0.96 mol·L-1時(shí)也保持相對(duì)較高的水平，而其平均發(fā)芽時(shí)間的延長也相對(duì)較少[9]。這與外源H2O2促進(jìn)鹽脅迫下黃瓜(Cucumissativus)[6]和小白菜(Brassicachinensis)[7]等植物種子萌發(fā)的研究結(jié)論相似。然而，高濃度(3.84～7.68 mol·L-1)外源H2O2引發(fā)時(shí)，燕麥種胚細(xì)胞內(nèi)H2O2含量會(huì)顯著升高(P<0.05)，盡管其SOD，CAT和GR活性仍顯著高于CK(P<0.05)，但其APX，MDHAR和DHAR活性除引發(fā)6 h外均已顯著低于CK(P<0.05)，其MDA含量也顯著高于CK(P<0.05)，這表明燕麥種胚細(xì)胞內(nèi)AsA-GSH循環(huán)抗氧化能力已經(jīng)不足以維持其H2O2平衡，從而導(dǎo)致其脂質(zhì)過氧化損傷急劇加重。因此，高濃度的外源H2O2引發(fā)處理顯著降低了燕麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及幼苗活力指數(shù)(P<0.05)，并顯著提高了其平均發(fā)芽時(shí)間(P<0.05)[9]。本試驗(yàn)中，高濃度(3.84～7.68 mol·L-1)外源H2O2引發(fā)下，燕麥種胚細(xì)胞內(nèi)SOD，CAT和GR活性仍顯著高于CK(P<0.05)，而其APX，MDHAR和DHAR活性則除引發(fā)6 h外均已顯著低于CK(P<0.05)，這說明其APX，MDHAR和DHAR是調(diào)控其H2O2平衡的關(guān)鍵酶，這與燕麥種子老化研究的結(jié)論相似[4,14]。

外源H2O2對(duì)植物種子萌發(fā)的影響不僅與其濃度高低有關(guān)，還與其處理時(shí)間的長短有密切關(guān)系[9]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除濃度為0和0.96 mol·L-1外，相同濃度外源H2O2引發(fā)下，燕麥種胚細(xì)胞內(nèi)H2O2及MDA含量均隨引發(fā)時(shí)間的延長而顯著升高(P<0.05)，這表明引發(fā)時(shí)間越長，細(xì)胞內(nèi)H2O2積累量就越多，其脂質(zhì)過氧化損傷也就越嚴(yán)重。然而，低濃度(0.96 mol·L-1)外源H2O2引發(fā)下，燕麥種胚細(xì)胞內(nèi)SOD，CAT和GR活性均隨著引發(fā)時(shí)間的延長而升高，APX，MDHAR和DHAR活性呈先升高后下降的趨勢，所以燕麥種胚細(xì)胞內(nèi)H2O2及MDA含量在低濃度外源H2O2引發(fā)下隨引發(fā)時(shí)間的延長而增加的幅度相對(duì)較少，因而對(duì)其種子活力的影響也相對(duì)較小[9]。然而，高濃度(3.84～7.68 mol·L-1)外源H2O2引發(fā)下，燕麥種胚細(xì)胞內(nèi)SOD，CAT，APX，MDHAR，DHAR和GR活性均隨引發(fā)時(shí)間由6 h延長到18 h而降低，這說明引發(fā)時(shí)間越長，其AsA-GSH循環(huán)抗氧化能力也就越低，因而燕麥種子活力也就喪失的越嚴(yán)重[9]。燕麥種胚細(xì)胞內(nèi)SOD,CAT和GR活性在引發(fā)12和18 h時(shí)仍顯著高于CK(P<0.05)，而其APX，MDHAR和DHAR活性則顯著低于CK(P<0.05)，這說明燕麥種胚細(xì)胞AsA-GSH循環(huán)的抗氧化能力在外源H2O2引發(fā)條件下主要依賴APX，MDHAR和DHAR來發(fā)揮作用。研究燕麥種子老化也發(fā)現(xiàn)種胚細(xì)胞內(nèi)APX和MDHAR活性下降是其H2O2的積累的主要原因[14]。

4 結(jié)論

外源H2O2引發(fā)對(duì)燕麥種胚細(xì)胞抗氧化能力的影響與其引發(fā)濃度和時(shí)間有關(guān)，低濃度(0.96 mol·L-1)或短時(shí)間(6 h)引發(fā)時(shí)能夠提高燕麥種胚細(xì)胞AsA-GSH循環(huán)的抗氧化能力，而高濃度(3.84～7.68 mol·L-1)或長時(shí)間(12～18 h)則相反。外源H2O2引發(fā)導(dǎo)致燕麥種胚細(xì)胞H2O2和丙二醛含量增加，而抗壞血酸過氧化物酶，單脫氫抗壞血酸還原酶和脫氫抗壞血酸還原酶是外源H2O2引發(fā)下燕麥種胚細(xì)胞內(nèi)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)清除H2O2的關(guān)鍵酶，這與種子老化過程中內(nèi)源H2O2的影響一致，為深入探究H2O2影響種胚細(xì)胞AsA-GSH循環(huán)抗氧化性能的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)，有利于燕麥種子的長期貯藏與科學(xué)利用。