孟杏楠, 張 靜, 夏明慧, 曹君璇, 樊婷婷

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

隨著現(xiàn)代工業(yè)的飛速發(fā)展,工業(yè)污染的問(wèn)題也日漸明顯,其中重金屬(如鎘)向生物圈的排放也日益增大[1],探索重金屬脅迫的作用機(jī)理以及提高植物抗重金屬的能力具有重要的理論以及實(shí)際意義,而尋找提高植物抗重金屬的關(guān)鍵基因并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)植物品種進(jìn)行改良是解決重金屬污染的一種行之有效的方法[2]。本文通過(guò)鎘脅迫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),AtRFE6基因敲除后的擬南芥對(duì)鎘脅迫有所響應(yīng)。為了進(jìn)一步探究基因AtRFE6響應(yīng)鎘脅迫的機(jī)制,本文克隆了AtRFE6基因的啟動(dòng)子,以GUS蛋白為標(biāo)記蛋白構(gòu)建Pro:RFE6-GUS重組質(zhì)粒,并通過(guò)基因工程手段構(gòu)建Pro:RFE6-GUS轉(zhuǎn)基因植株,以期通過(guò)觀察GUS蛋白在鎘脅迫時(shí)的表達(dá)量監(jiān)測(cè)AtRFE6基因的表達(dá)情況,為進(jìn)一步探究該基因在擬南芥響應(yīng)鎘脅迫中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用植物為野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana),購(gòu)于美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源中心,均為哥倫比亞(Columbia,Col) 遺傳背景,后由合肥工業(yè)大學(xué)植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室繁殖所得。

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)于Thermo Scientific;高保真DNA聚合酶、PrimeScript RT-PCR Kit,均購(gòu)于Takara;TIANprep Mini Plasmid Kit 、瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒,均購(gòu)于TIANGEN;限制性內(nèi)切酶SacⅠ、XhoⅠ、T4-DNA Ligase,均購(gòu)于NEB;Silwet77購(gòu)于索萊寶;氯仿、瓊脂、乙醇、異丙醇、酵母粉、蛋白胨、蔗糖,均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán);壯觀霉素、卡那霉素、慶大霉素,均購(gòu)買于生工生物工程(上海) 股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥土培苗的培養(yǎng)

將蛭石、黑土、珍珠巖以體積比為9∶3∶1進(jìn)行混勻分裝入花盆,待土吸濕完成后,將擬南芥種子用牙簽均勻點(diǎn)在土層表面,再用保鮮膜封盆,隨后置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng),待擬南芥發(fā)芽并生長(zhǎng)至4片葉子即可揭膜。其中光照培養(yǎng)室的條件[3]為培養(yǎng)溫度25 ℃,光照16 h、黑暗8 h。

1.2.2 基因組DNA的提取

取擬南芥葉片約0.2 g于EP管中,破碎葉片并加入400 μLSDS提取液,4 ℃,10 000g離心10 min,再取200 μL的上清于EP管,加入200 μL的異丙醇,室溫10 000g離心5 min,棄上清,留沉淀,于通風(fēng)櫥中吹5～8 min晾干。向EP管中加入40 μL的雙蒸水,即得到DNA。其中SDS提取液配制時(shí),每200 mLSDS提取液中加入40 mL pH值 7.5、濃度為1 mol/L的Tris-HCl溶液,12 mL濃度為4 mol/L的NaCl溶液,10 mL濃度為0.5 mol/L的EDTA溶液以及4 mL 20%的SDS溶液,再用134 mL雙蒸水補(bǔ)足至200 mL。

1.2.3RFE6啟動(dòng)子片段的克隆

利用Oligo7引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物:

FP:5’-CGAGCTCGTGTGAACTTTATTTTG-3’,

RP:5’-CCGCTCGAGTGATAAAATTTTCAAAA-3’。

以野生型擬南芥DNA為模板,進(jìn)行基因克隆。設(shè)置聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)條件為98 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,進(jìn)行基因克隆,32個(gè)循環(huán)完成后,進(jìn)行跑膠電泳。

1.2.4 載體的構(gòu)建

酶切所用體系為50 μL,分別取43 μL克隆基因片段和20 μL的質(zhì)粒加入2個(gè)EP管中,再加入5 μL的Cutsmart、SacⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶各1 μL,質(zhì)粒用雙蒸水補(bǔ)足至50 μL,置于37 ℃金屬浴中進(jìn)行酶切,其中片段酶切2 h,質(zhì)粒酶切4 h[4]。將GUS載體質(zhì)粒與克隆所得片段雙酶切,膠回收后以質(zhì)粒與片段質(zhì)量比為3∶1的比例用T4-DNA Ligase進(jìn)行16 ℃連接16 h。取5 μL的連接產(chǎn)物加入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中,冰浴30 min,再42 ℃熱激50 s,隨后立即冰浴2 min。再加入700 μL無(wú)抗性的液體LB培養(yǎng)基,37 ℃活化1 h后涂布于含壯觀霉素抗性的固體LB培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,待長(zhǎng)出單克隆菌落后,挑取單克隆菌體于50 μg/mL壯觀抗性的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至渾濁再進(jìn)行PCR鑒定,鑒定所用的引物為:

FP:5’-CGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG-3’,

RP:5’-TGATAAAATTTTCAAAA-3’。

板澗河調(diào)蓄水庫(kù)已具備蓄水條件，為下閘蓄水驗(yàn)收奠定了基礎(chǔ)。運(yùn)行中要加強(qiáng)觀測(cè)、分析，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)處理，保證水庫(kù)、大壩的安全運(yùn)行，充分發(fā)揮小浪底引黃工程效益。

鑒定完成后選取陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建

載體構(gòu)建完成并且測(cè)序比對(duì)正確后,將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)中,活化后均勻涂布于50 μg/mL慶大霉素和壯觀霉素雙抗性LB培養(yǎng)基上,于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d左右,待長(zhǎng)出農(nóng)桿菌單克隆菌落后,挑取單克隆菌體于液體雙抗LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并鑒定,鑒定正確即可轉(zhuǎn)接至100 mL的雙抗LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.6。將農(nóng)桿菌菌液常溫下3 000 r/min離心10 min集菌,再用緩沖液(每100 mL 雙蒸水加0.218 g 1/2 MS培養(yǎng)基、6 g蔗糖)清洗2遍菌體,最終用緩沖液重懸菌體至OD600=0.4左右,每4 mL菌液中加入1 μL Silwet77,實(shí)驗(yàn)菌液即制備完成。實(shí)驗(yàn)所用的材料為土培4周的野生型擬南芥,剪去成熟的果莢,只留下花苞,將花苞浸入菌液中30 s,用保鮮膜封閉后黑暗處理過(guò)夜,第2天揭去保鮮膜。1周后再次侵染。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的篩選

在收獲擬南芥侵染后的的F0代種子后,置于37 ℃培養(yǎng)箱烘干2周,除去雜質(zhì),再放于4 ℃冰箱春化約1周即可用于篩選實(shí)驗(yàn)。篩選陽(yáng)性植株所用的培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基和50 μg/mL那霉素抗性培養(yǎng)基,配置時(shí)每100 mL 水加入0.218 g1/2 MS培養(yǎng)基、1 g蔗糖和1.2 g瓊脂。將混合液pH值調(diào)至5.8后,置于滅菌鍋中121 ℃、20 min滅菌完成,待培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右,加入100 μL質(zhì)量濃度為50 mg/mL的卡那霉素?zé)o菌溶液,混勻后均勻倒入培養(yǎng)皿中,待培養(yǎng)基凝固吹干皿蓋水分。擬南芥種子用0.1%的HgCl2洗滌30 s除去細(xì)菌,隨即用無(wú)菌水沖洗3遍沖去殘余HgCl2,將種子鋪在濾紙上晾干即可開(kāi)始播種。播種完成的培養(yǎng)皿封口置于4 ℃春化2～3 d后即可水平置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周。2周后選取培養(yǎng)基中根系發(fā)達(dá),葉片嫩綠的陽(yáng)性植株移入土培。待幼苗長(zhǎng)大后即可采葉片提取DNA進(jìn)行鑒定。

1.2.7 擬南芥植株GUS染色

將待染色的材料置于90%的丙酮溶液中真空抽濾0.5 h,用雙蒸水沖洗3遍,用濾紙吸干殘余在植物表面的雙蒸水,再用試劑盒對(duì)材料進(jìn)行染色。實(shí)驗(yàn)所用的試劑盒為北京華越洋GUS染色試劑盒。

2 結(jié)果分析

2.1 RFE6啟動(dòng)子片段的克隆

圖1 擬南芥RFE6啟動(dòng)子片段的克隆

2.2 目的片段和GUS質(zhì)粒的雙酶切

用內(nèi)切酶分別對(duì)質(zhì)粒和克隆片段酶切以后,將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖2所示,由圖2可知，酶切產(chǎn)物完整無(wú)雜帶且無(wú)拖尾現(xiàn)象,酶切效果良好,將酶切產(chǎn)物膠回收后,使用T4-DNA Ligase對(duì)片段和質(zhì)粒進(jìn)行16 ℃連接16 h。

圖2 基因和質(zhì)粒雙酶切

2.3 重組質(zhì)粒單克隆菌落的PCR鑒定

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌,涂于壯觀霉素抗性LB固體培養(yǎng)基上,挑取單克隆菌落于壯觀霉素抗性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至渾濁即可進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，擴(kuò)增條帶大小與目標(biāo)條帶一致,選取PCR條帶清晰的單克隆菌體進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序比對(duì)正確后擴(kuò)大培養(yǎng),并且用質(zhì)粒提取試劑盒提質(zhì)粒,即得到Pro:RFE6-GUS重組載體質(zhì)粒。

圖3 大腸桿菌菌落PCR鑒定

2.4 農(nóng)桿菌陽(yáng)性克隆的PCR鑒定

將測(cè)序正確陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌,活化后涂于雙抗性LB固體培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)2 d左右,挑取單克隆于液體雙抗性培養(yǎng)基里培養(yǎng)至渾濁即可進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，條帶清晰明亮,說(shuō)明質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。

圖4 農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的篩選及鑒定

利用農(nóng)桿菌通過(guò)浸花法侵染野生型擬南芥后,將所獲得的種子種植于含有卡那霉素抗性的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,如圖5所示。從圖5可以看出，侵染成功的轉(zhuǎn)基因植株能夠正常生長(zhǎng),野生型植株則出現(xiàn)葉片黃化偏小,且根系不發(fā)達(dá)等非正常生長(zhǎng)現(xiàn)象。

圖5 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株抗性篩選

正常生長(zhǎng)的幼苗于培養(yǎng)皿里生長(zhǎng)2周后移至土培生長(zhǎng)。同時(shí),為排除植株出現(xiàn)假陽(yáng)性,在轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)至4周左右時(shí)轉(zhuǎn)基因植株提DNA進(jìn)行PCR鑒定,以排除假陽(yáng)性植株。

2.6 Pro:RFE6-GUS轉(zhuǎn)基因植株染色

Pro:RFE6-GUS轉(zhuǎn)基因植株GUS染色結(jié)果如圖6所示。

從圖6可看出,Pro:RFE6-GUS轉(zhuǎn)基因植株種子于無(wú)抗性的1/2 MS培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)7 d后,一組用濃度為50 μmol/L的CdCl2溶液處理6 h,另一組作空白對(duì)照,然后對(duì)2組樣品進(jìn)行GUS染色,從結(jié)果可以看出,未處理的擬南芥幼苗染色偏淺,且只有根部染上了淺藍(lán)色,而經(jīng)過(guò)CdCl2處理6 h的幼苗染色偏深,且除了根以外,葉和莖都染上了顏色。說(shuō)明當(dāng)擬南芥被鎘處理后,植物為應(yīng)對(duì)鎘脅迫啟動(dòng)了AtRFE6的表達(dá),從而增加了GUS蛋白的表達(dá)量。

圖6 Pro:RFE6-GUS轉(zhuǎn)基因植株GUS染色結(jié)果

3 結(jié) 論

鎘作為一種有毒的非必需金屬,對(duì)人和動(dòng)物都有毒害作用[5-7],環(huán)境中的鎘污染主要來(lái)源于工業(yè)和農(nóng)業(yè),鎘在動(dòng)物和植物體內(nèi)的半衰期[8]能達(dá)到20～30 a。農(nóng)田被鎘污染后,環(huán)境中的鎘被植物吸收,不僅會(huì)影響植物的生長(zhǎng),同時(shí)會(huì)隨食物鏈富集到人類體內(nèi),造成不可逆的傷害[9-10]?？寺≈参锬玩k關(guān)鍵基因并闡明其作用機(jī)制,對(duì)于利用植物修復(fù)基因工程技術(shù)治理土壤重金屬污染具有重要的理論意義和潛在應(yīng)用價(jià)值。擬南芥基因AtRFE6能夠?qū)︽k脅迫作出應(yīng)答,在植物體內(nèi)可能通過(guò)改變自身和相關(guān)基因表達(dá)量以及相應(yīng)蛋白活性來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)。因此,探究AtRFE6在應(yīng)對(duì)鎘脅迫中的響應(yīng)及其作用機(jī)理具有重要意義。