劉海林 ，羅子燕 ，朱建軍 ，鄧運江 ，曾勇波 ，周元中 ，張翠永 ，朱立軍 ，燕海峰

（1.湖南光大牧業(yè)科技有限公司，湖南 長沙 410131；2.湘西自治州畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心，湖南 吉首 416000；3.寧鄉(xiāng)市動物疫病預(yù)防控制中心，湖南 長沙 410600；4.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長沙 410131）

隨著我國經(jīng)濟的迅速發(fā)展，消費者對肉質(zhì)的要求與日俱增；同時“卡脖子”的種業(yè)難題等讓國家對地方豬品種非常重視，湖南地方豬中的寧鄉(xiāng)豬、沙子嶺豬、湘西鐵骨豬和大圍子豬均列入地方保護品種范圍，并對其進行大量品種改良工作。

非洲豬瘟等烈性傳染病的肆虐對地方豬品種造成了毀滅性的打擊；為加快對地方豬保種和品種改良工作，許多省份開展了地方豬精液冷凍技術(shù)的研發(fā)；但目前尚無統(tǒng)一的生產(chǎn)標準，且凍精的解凍后活力偏低、畸形率高，從而導(dǎo)致母豬配懷率和產(chǎn)仔率低等；因此，需要從凍精制作的原精處理、冷凍和解凍等各個環(huán)節(jié)進行優(yōu)化處理，提高豬凍精質(zhì)量。

本研究以湖南地方豬精液為素材，對凍精制作的精液稀釋、冷凍方法以及凍精解凍方法三個方面進行探討，為湖南地方豬精液冷凍保種庫的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

常溫稀釋粉（AndroPro? Plus）；冷凍稀釋粉（AndroheP?CryoGuard）；Equex-Paste；解凍劑（AndroheP CryoGuard Thaw）均為法國米尼圖提供。

視頻溫控顯微鏡（HW-39A，江西新怡光學(xué)儀器有限公司）；恒溫磁力攪拌器（78HW-1，金壇市醫(yī)療儀器廠）；電子天平（ES-500HA，長沙湘平科技發(fā)展有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-SI，金壇市醫(yī)療儀器廠）。程序冷凍儀（法國米尼圖公司）。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 探討精液稀釋方法

取2歲左右成年湘西鐵骨種公豬3頭，每頭重復(fù)采精6次，每次采集間隔5 d。每頭每次采精的精液平均分為3份（編號為001、002、003）。二次稀釋法：是指精液在15℃降溫至4℃的過程中，用冷凍保護劑進行二次稀釋。三次稀釋法：是在采集精液后到離心前，用常溫稀釋液進行1∶1稀釋；之后再由冷凍保護劑進行二次稀釋。001不進行常溫稀釋（二次稀釋法）；002和003分別在原場地和試驗室進行常溫稀釋（三次稀釋法）。

1.2.2 探討精液冷凍方法

取2歲左右成年、體質(zhì)健康、精液品質(zhì)穩(wěn)定的寧鄉(xiāng)豬、大圍子豬、沙子嶺豬和湘西鐵骨種公豬各6頭，每頭重復(fù)采精3次，每次采集間隔4～5 d。

液氮噴入法：將平衡后的細管迅速轉(zhuǎn)移到程序冷凍儀中，降溫冷凍程序為：5℃降至-10℃時間為3 min，-10℃降至-100℃的時間為2.5 min，-100℃降至-140℃時間為2 min，最后在-140℃下裝入袋中，做好標記，最后快速投入液氮中。

液氮距離一步法：將平衡后的細管迅速轉(zhuǎn)移到小型泡沫箱內(nèi)不同高度的泡沫架上（泡沫箱規(guī)格：長30 cm，寬22 cm，高20 cm），泡沫架上距離液氮面3 cm，冷凍8 min后，迅速投入液氮中。

液氮距離多步法：將平衡后的細管迅速轉(zhuǎn)移到自動升降冷凍裝置上，分別為上1 cm、上0 cm、下1 cm、下2 cm和下3 cm。 冷凍后迅速投入液氮中。

1.2.3 探討凍精解凍方法

隨機選擇寧鄉(xiāng)豬、大圍子豬、沙子嶺豬和湘西鐵骨豬合格凍精，在不同時間段進行5次測試，每個試驗組每次3個重復(fù)。解凍方法為：38℃30 s、42℃25 s、47℃20 s、52℃15 s、57℃10 s和62℃5 s。

1.3 采精與預(yù)處理

采用手握法收集射精中間部分的精液，過濾膠質(zhì)部分后，按試驗設(shè)計進行預(yù)處理。選擇稀釋活力超過0.5的進行下一步操作。

1.4 冷凍保護液的制備

冷凍保護液I：將44 g冷凍稀釋粉溶解于400 mL預(yù)熱的蒸餾水中，加入100 mL雞蛋黃，拌勻；冷卻至17℃ 后待用。

冷凍保護液Ⅱ：將40.7 g冷凍稀釋粉完全溶解于370 mL預(yù)熱的蒸餾水中，加入100 mL雞蛋黃，拌勻；再加30 mL甘油，拌勻；再加入5 mL Equex Paste，拌勻；冷卻至4℃后待用。

1.5 離心、稀釋、平衡與裝管

將預(yù)處理后的精液轉(zhuǎn)移到離心瓶中，在17℃和每分鐘轉(zhuǎn)速2 750的條件下離心10～12 min，棄上清。按預(yù)設(shè)的凍精密度計算好冷凍保護液添加量后，加入冷凍保護液I，混勻，放入盛有蒸餾水（17℃）的燒杯中，在4℃的冰箱中平衡1.5～2h。

將冷凍保護液Ⅱ緩慢地加到4℃的精液中，輕輕晃動來混合均勻。

在4℃條件下，15 min內(nèi)完成每頭份精液的裝管（0.25 mL），封口；再轉(zhuǎn)移到4℃的冷凍冰柜中，平衡3 h。

1.6 冷凍

試驗一采用液氮噴入法，試驗二采用液氮噴入法、液氮距離一步法和液氮距離多步法。

1.7 解凍

從液氮罐中迅速取1支細管，放入38℃水浴鍋中晃動30 s（試驗一和試驗二均采用此解凍方法），剪去空氣端，注入1 mL預(yù)熱的解凍液中，搖勻放入水浴鍋（38℃）靜置1 min后檢測活力。

1.8 活力、畸形率和頂體完整率的測定

通過米尼圖精子分析系統(tǒng)選取樣品中3處不同視角來測量精液活力。

采用姬姆薩染色法測定精子畸形率和頂體完整率。

1.9 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用SPASS25.0統(tǒng)計軟件進行差異顯著性檢驗和單因素方差分析比較，結(jié)果用平均值±標準差表示（mean±sem）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稀釋方法對鐵骨豬精液冷凍效果的影響

不同稀釋方法下，鐵骨豬精液冷凍前活力差異不顯著（P＞0.05）。

采用三次稀釋法的鐵骨豬精液冷凍后活力極顯著高于二次稀釋法試驗組（P＜0.01）；其中采用實驗室稀釋的精液冷凍后活力為63.4%，高于原場稀釋的53.8%，但差異不顯著（P＞0.05）。

不同稀釋方法下，鐵骨豬精液冷凍后畸形率差異極顯著（P＜0.01）；二次稀釋法畸形率極顯著高于三次稀釋法試驗組（P＜0.01），三次稀釋試驗組之間的畸形率差異不顯著（P＞0.05）。

二次稀釋法下，鐵骨豬精液冷凍后的頂體完整率要極顯著低于三次稀釋法試驗組（P＜0.01）。見表1。

表1 不同稀釋方法對鐵骨豬精液冷凍效果的影響（%，n=6）

2.2 不同稀釋和冷凍方法對湖南地方豬精液冷凍后活力的影響

由表2可知，不同冷凍方法下，二次稀釋法的凍后活力均顯著低于三次稀釋法試驗組（P＜0.05）；不同的冷凍方法下，原場和實驗室稀釋的試驗組凍后活力均無顯著差異（P＞0.05）。

表2 不同稀釋和冷凍方和對湖南地方豬精液冷凍后活力的影響（%，n=8）

二次稀釋法下，不同冷凍方法的試驗組之間凍后活力無顯著差異（P＞0.05）；在三次稀釋法下，采用液氮噴入法的凍后活力均顯著高于距離一步法和距離多步法的試驗組（P＜0.05），距離一步法和距離多步法的試驗組之間無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 不同解凍方法對湖南地方豬精液解凍效果的影響

由表3可見，從凍精活力來分析，52℃15 s的試驗組最高，為34.5%，其次是38℃30 s，為33.6%，兩者差異不顯著（P＞0.05）；62℃5 s最低為23.2%，極顯著低于52℃15 s和38℃30 s試驗組（P＜0.01），凍精活力隨解凍溫度的升高有先上升后下降的趨勢。38℃30 s試驗組的畸形率為13.26%，極顯著低于其他5組（P＜0.01）。頂體完整率方面，38℃30 s和42℃25 s組極顯著高于其他4組（P＜0.01），兩者差異不顯著（P＞0.05）；62℃5 s試驗組最低，為28.1%，極顯著低于其他5組；當解凍溫度超過42℃后，隨著解凍溫度的升高，頂體完整率有明顯的下降趨勢。

表3 不同解凍方法對湖南地方豬精液解凍效果的影響（%，n=15）

3 討論

3.1 不同的稀釋方式對鐵骨豬精液冷凍效果的影響

目前的豬精液冷凍技術(shù)研究中，原精處理主要有二次稀釋法和三次稀釋法，稀釋的目的是盡可能減少甘油和溫度變化等對精子的損傷。

試驗一中發(fā)現(xiàn)，不同稀釋方法下鐵骨豬冷凍前活力無顯著差異（P＞0.05），本次試驗由于原場地設(shè)備不夠，沒有檢測原精活力，因而無法判斷不同稀釋方法對原精采集到實驗室稀釋后精子活力的變化情況，這需要進一步的研究。

本次試驗中，采用三次稀釋法的試驗組凍后活力均極顯著高于二次稀釋試驗組（P＜0.01），說明在精液離心前進行稀釋可提高其凍后活力，這可能是本次試驗的凍精制作點離公豬場較遠，運輸時間長，此外運輸中的晃動等會降低精子活力；因而通過1∶1稀釋來增加精子營養(yǎng)供給和精子運動緩沖余地，從而有效維持精子活力。

三次稀釋法中，采用實驗室稀釋的精液冷凍后活力要高于原場稀釋的試驗組，但差異不顯著，這可能與原場的稀釋設(shè)備和環(huán)境條件落后等有關(guān)。

3.2 不同稀釋和冷凍方法對湖南地方豬精液凍后活力的影響

試驗二發(fā)現(xiàn)，在液氮噴入法和距離一步法冷凍方法下，二次稀釋法的凍后活力均極顯著低于三次稀釋法的試驗組（P＜0.01），在距離多步法法下，二次稀釋法的凍后活力均顯著低于三次稀釋法的試驗組（P＜0.05），而凍前活力均無顯著差異（P＞0.05）；這說明二次稀釋法對冷凍過程的精子活力降低有影響，這進一步驗證了試驗一的結(jié)果，其原因可能是精子的頂體結(jié)構(gòu)等在冷凍前就遭到了一定程度的破壞，在超低溫冷凍過程中加速了精子的凋亡，從而導(dǎo)致解凍后的活力下降。

在豬精液冷凍過程中，降溫速率最為關(guān)鍵，在4～5℃降至1℃要緩慢，讓卵黃、甘油等冷凍保護劑與精液充分融合，同時避免精子發(fā)生不可逆的冷休克現(xiàn)象；但在危險溫區(qū)（0至-60℃），需要迅速降溫，促進精液快速形成玻璃化結(jié)構(gòu)，從而降低精子損傷比例。目前豬凍精技術(shù)中的降溫方式主要是采用液氮熏蒸，其中有噴入法（控制噴入的液氮量來進行分段降溫） 和距離法兩種（控制樣品離液氮面的高度來實現(xiàn)降溫） ，前者設(shè)備昂貴且液氮消耗量大，但操作方便，自動化程度高；后者裝置簡單廉價且消耗液氮少，但目前沒有國家統(tǒng)一標準，對每個環(huán)節(jié)的操作經(jīng)驗要求較高。

本試驗二中采用的液氮距離法分一步法和多步法，國內(nèi)許多研究以一步法來制作凍精，操作相對簡單，但不能精確控制降溫速度；多步法可結(jié)合超低溫溫度儀來控制精液冷凍降溫速率，這與液氮噴入法的原理一致。

在二次稀釋法下，不同冷凍法試驗組之間凍后活力無顯著差異（P＞0.05），這說明冷凍法沒有影響精子冷凍過程中的活力變化，進一步證實精子損傷發(fā)生在原精采集到冷凍前這一過程中。在原場地的三次稀釋法下，液氮噴入法的凍后活力極顯著高于液氮距離法（P＜0.01），這說明三次稀釋法與液氮噴入法結(jié)合對精子結(jié)構(gòu)的保護產(chǎn)生有益的組合效應(yīng)，這需要進一步驗證。在三次稀釋法下，距離一步法和距離多步法的試驗組之間無顯著差異（P＞0.05），距離多步法均略低于距離一步法試驗組，這與本次試驗條件與制作材料均有一定的關(guān)系。

3.3 不同解凍方法對湖南地方豬精液解凍效果的影響

適當?shù)慕鈨鰷囟饶茏尵嚎焖偻ㄟ^冰晶化形成的危險溫度區(qū)，從而降低對精子的損傷；適宜解凍時間讓精液液化后，溫度緩慢上升到10～17℃之間，從而延長精子活力的維持時間。國內(nèi)外研究表明，解凍溫度主要集中在溫水（30～40℃）和高溫水（50～70℃）兩個區(qū)間，與劑量、解凍時間和精子密度等均具有一定的相關(guān)性。

目前國內(nèi)商用化豬（杜長大等外來品種）凍精主要有0.25 mL和0.5 mL兩種劑型，精子密度為4億/mL，解凍方法為：0.25 mL，38℃20 s；0.5 mL，50℃15～16 s。地方豬品種的解凍方法差異性很大：梅山豬，0.25 mL細管，38℃30 s；版納微型豬0.5 mL細管，40℃6 s；廣東小耳花豬0.5 mL細管，50℃15 s；巴馬香豬，55℃10 s，這些研究表明，解凍溫度與解凍時間呈反比的關(guān)系；目前國內(nèi)關(guān)于解凍密度與解凍溫度和時間的關(guān)系尚無相關(guān)報道。

本試驗從保種角度考慮，選擇高于商品豬密度（4億/mL），達到≥6.6億/mL；結(jié)合牛凍精的成功制作經(jīng)驗，選擇0.25 mL規(guī)格的細管；同時參考以上國內(nèi)兩個解凍溫區(qū)和解凍時間，設(shè)定6組解凍參數(shù)：38℃30 s、42℃25 s、47℃20 s、52℃15 s、57℃10 s和62℃5 s。

綜合本次檢測的活力、畸形率和頂體完整率3個指標，確定以38℃30s的試驗組解凍后精液質(zhì)量最佳。

4 結(jié)論

本研究在同等條件下，探討不同稀釋、冷凍和解凍方法對湖南地方豬精液冷凍效果的影響。研究結(jié)果表明，湖南地方豬凍精的最佳制作方法為：采用三次稀釋法（實驗室稀釋）處理精液，選擇液氮噴入法制作凍精，用38℃30 s的解凍方法進行0.25 mL細管凍精的解凍。