趙飛

遼寧省檢驗檢測認證中心（沈陽 110000）

GB 19300—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 堅果與籽類食品》中對堅果與籽類食品定義為以堅果、籽類或其籽仁為主要原料，經(jīng)加工制成的食品，如板栗、杏核、開心果、松籽等。堅果與籽類食品口味獨特，營養(yǎng)豐富，且富含多種營養(yǎng)素[1]。隨著生活水平的提高，堅果與籽類食品得到消費者的關(guān)注和喜愛，該類食品的年消費量也隨之增高[2]。歐盟食品和飼料快速警報系統(tǒng)報告顯示，真菌毒素是堅果與籽類食品中報告頻率最高的有害物質(zhì)[3-4]。根據(jù)2020年遼寧省食品安全抽檢信息公布結(jié)果，有一批油炸花生米檢出黃曲霉毒素B1超限量[5]。已發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有20余種，主要包括B1、B2、G1、G2、M1、M2，其中黃曲霉毒素B1的毒性最強[6-7]。黃曲霉毒素B1的提取主要是采用合適的有機溶劑或有機溶液[8]，對于部分樣品，也可向提取溶劑或溶液中加入適量有機酸，更好地保持穩(wěn)定的酸堿度。黃曲霉毒素B1檢測的凈化方法主要有稀釋法[9-10]、分子印跡技術(shù)[11]、免疫親和柱[12]、固相萃取柱[13]和QuEChERS[14-15]等。食品中黃曲霉毒素B1的檢測方法主要有高效液相色譜法[16-17]、液相色譜-質(zhì)譜法[18-20]、熒光探針法[21]和酶聯(lián)免疫吸附法[22-23]等。其中，液相色譜-質(zhì)譜法具有分析結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、分離度好、分析速度快、操作簡便、省時的優(yōu)勢等，該檢測技術(shù)結(jié)合快速樣品前處理方法，具有高靈敏度和優(yōu)異的選擇性[10]。微波萃取是一種高效的樣品前處理方法[24]。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多環(huán)芳烴、有機磷農(nóng)藥等檢測[24-26]，一定程度解決有機溶劑用量大、檢測成本高等問題。試驗將微波萃取與液相色譜-質(zhì)譜法相結(jié)合，用于堅果與籽類食品中黃曲霉毒素B1的測定，為堅果與籽類食品中黃曲霉毒素B1的快速篩查與檢測提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；試驗用水為Mili Q超純水。

標(biāo)準(zhǔn)品：黃曲霉毒素B1（質(zhì)量濃度25.0 μg/mL，青島普瑞邦生物工程有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

A10 Milli Q超純水機（美國Millipore公司）；島津8050超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本島津公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品溶液制備

取一定量且具有代表性的堅果與籽類食品，經(jīng)粉碎機粉碎并混合均勻。稱取5 g（精確至0.01 g）上述樣品于微波消解罐中，準(zhǔn)確加入10 mL甲醇，渦旋30 s使樣品與甲醇充分接觸，后將其置于微波消解儀中進行微波萃取，萃取條件：0～3 min，20～80 ℃；3～8 min，80 ℃保持。待萃取完成，冷卻至室溫，慢慢旋開微波消解罐蓋子，將提取液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，并用甲醇清洗剩余殘渣，清洗液合并至容量瓶中，最后用甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，濾液置于進樣小瓶中待測。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為Acquity BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A為水，流動相B為甲醇。梯度洗脫程序：0～0.5 min，90% A；0.5～1.5 min，90% A～70% A；1.5～2.0 min，30% A～30% A；2.0～2.5 min，30% A～60% A；2.5～3.0 min，60% A～60% A；3.0～3.5 min，60% A～90% A。流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣體積5 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子化方式ESI；掃描方式為正離子；檢測方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測；接口溫度300 ℃；噴霧電壓2.5 kV；干燥氣流量10 L/min；霧化氣流量3 L/min；定量離子對313.2/285.1；定性離子對313.2/241.2；Q1 Pre偏差-25 V；Q3 Pre偏差-29 V；碰撞能量-25 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件的優(yōu)化

以不含黃曲霉毒素B1的花生為樣品，分別平行稱量5.00 g經(jīng)充分的粉碎混勻的樣品進行加標(biāo)試驗，加標(biāo)量0.6 μg/kg。加標(biāo)后的樣品均放置過夜，使黃曲霉毒素B1充分滲透到花生基質(zhì)中，以此探索優(yōu)化提取條件。

2.1.1 萃取溶劑的選擇

分別選取甲醇、乙腈、乙酸乙酯和30%甲醇溶液作為微波萃取劑，采用相同的微波萃取程序?qū)訕?biāo)回收試驗樣品進行微波萃取，并采用優(yōu)化的色譜條件和質(zhì)譜條件對提取溶液進行檢測。結(jié)果顯示，相同條件下，當(dāng)以甲醇作為微波萃取劑時，萃取回收率和精密度最好，因此研究中最終選擇以甲醇作為微波萃取劑。

2.1.2 萃取溫度的優(yōu)化

以甲醇作為微波萃取劑，萃取最高溫度分別設(shè)置為60，70，80和90 ℃，其他條件相同，對加標(biāo)回收試驗樣品進行微波萃取，并采用優(yōu)化的色譜條件和質(zhì)譜條件對提取溶液進行檢測。結(jié)果顯示，當(dāng)萃取最高溫度設(shè)置為80 ℃時，萃取回收率和精密度均較好，因此本研究中以甲醇作為微波萃取劑，萃取最高溫度設(shè)置為80 ℃。

2.1.3 萃取時間的優(yōu)化

以甲醇作為微波萃取劑，萃取最高溫度設(shè)置為80 ℃，將微波萃取程序中溫度由室溫上升至80 ℃時間分別設(shè)置為2，3，4和5 min，80 ℃時保持時間均為3 min，經(jīng)微波萃取檢測，結(jié)果顯示，當(dāng)萃取溫度由室溫上升至80 ℃時，經(jīng)過3，4和5 min回收率無明顯差異，因此爬升時間設(shè)置為3 min。將萃取溫度由室溫上升至80 ℃時間設(shè)置為3 min，將80 ℃時保持時間分別設(shè)置為3，5，7和10 min，再進行微波萃取和檢測，通過檢測計算得到保持時間5 min時，回收率最高，因此選擇保持時間為5 min。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

參考GB 5009.22—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》第一法中黃曲霉毒素B1的條件，在正離子模式下，以質(zhì)量濃度300 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為測試液，依次對噴霧電壓、母離子、Q1 Pre偏差、子離子、碰撞能量、Q3 Pre偏差等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，優(yōu)化的參數(shù)見1.3.3質(zhì)譜條件。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

以5 ng/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液為測試液，采用Acquity BEH C18色譜柱進行分離分析，建立流動相梯度程序。并采用建立的色譜分離條件，對回收試驗溶液進行檢測，在黃曲霉毒素B1出峰時間無色譜干擾，優(yōu)化后的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的譜圖見圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

為保證試驗所建立的方法準(zhǔn)確性，對基質(zhì)效應(yīng)進行考察。分別配制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。以2條曲線的斜率比值來評價基質(zhì)效應(yīng)情況。結(jié)果表明，溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值小于0.8，說明采用該方法檢測堅果與籽類食品時，基質(zhì)中的成分對待測樣品中黃曲霉毒素B1的質(zhì)譜響應(yīng)具有明顯的抑制作用。制作基質(zhì)工作曲線，通過比較基質(zhì)工作曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，兩者無明顯差別。鑒于上述獲得的情況，為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對待測樣品進行定量。

2.5 方法學(xué)驗證

在優(yōu)化的最佳萃取條件和檢測條件下，以空白堅果與籽類樣品提取液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線；向空白樣品中分別添加3個濃度水平的黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并平行進行3次試驗，其余步驟同樣品溶液制備。黃曲霉毒素B1在0.25～10 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 4；以3倍噪聲的添加濃度為方法檢出限，方法的黃曲霉毒素B1檢出限為0.1 μg/kg；回收率為88.0%～101.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～ 4.1%，說明試驗方法有較好的準(zhǔn)確度和精密度，回收率和精密度的具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 回收率和精密度試驗結(jié)果表

2.6 樣品測定

采用試驗建立的微波萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法，對市售的堅果與籽類食品進行提取和檢測，共開展30批次的堅果與籽類食品的分析測試，在核桃和花生中檢出黃曲霉毒素B1，各1批次，但檢測結(jié)果均滿足GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》的規(guī)定。

3 結(jié)論

將微波萃取技術(shù)與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相結(jié)合，通過對色譜條件、質(zhì)譜條件，萃取條件進行優(yōu)化，對基質(zhì)效應(yīng)進行考察，得到并建立用于堅果與籽類食品中黃曲霉毒素B1的檢測方法。該方法以高靈敏度、高選擇性、快速高效、操作簡便、試驗成本低為主要特點，適用于堅果與籽類食品中黃曲霉毒素B1的快速定性篩查和定量檢測，為堅果與籽類食品中真菌毒素的檢測提供新方法。