倪榮，齊懿涵，馬曉璐，何惠利，張振，郭雪松

錦州醫(yī)科大學食品與健康學院（錦州 121000）

中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）是著名的對蝦品種，含有多種人體所需營養(yǎng)成分，其蛋白質(zhì)含量高，富含維生素等特點，然而蝦類在捕撈、運輸、販賣過程中極易受到微生物的影響發(fā)生黑變、腐敗，在蝦體繁殖的微生物隨著時間的增加而增加，會產(chǎn)生優(yōu)勢腐敗菌（specifific spoilage organism，SSO），加速產(chǎn)品腐敗。

冷藏是水產(chǎn)品中常用的保鮮方法，在4 ℃條件下，會產(chǎn)生特定的優(yōu)勢腐敗菌，加速產(chǎn)品的腐敗。Duan等[1]利用PCR-DGGE方法研究羅非魚片在4 ℃貯藏下的微生物群的演替規(guī)律，最終SSO為假單胞菌屬（Pseudomonas）在整個貯藏期間占據(jù)優(yōu)勢、Shewanella和Psychrobacter也在3 d后始終存在是優(yōu)勢菌。Lan等[2]研究表明，墨魚在4 ℃冷藏下的微生物多樣性變化，最終在腐敗末期，主要優(yōu)勢菌是Pseudomonas fragi29.5%，Pseudomonas. fluorescens33.4%，Shewanella putrefaciens32.0%，Staphylococcus sciuri5.1%。Sun等[3]結(jié)果表明在4 ℃貯藏下，腐敗草魚中假單胞菌（Pseudomonas）、腐敗希瓦菌（Shewanella）和氣單胞菌（Aeromonas）是草魚魚片的主要腐敗菌。

試驗選擇傳統(tǒng)培養(yǎng)基法，利用菌落形態(tài)特征，并通過細菌生理生化試驗結(jié)合16S rDNA分子鑒定出中國對蝦貯藏末期的腐敗菌。將SSO接種到無菌蝦肉上，以pH、菌落總數(shù)（TVC）、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）和腐敗物質(zhì)產(chǎn)量YTVB-N/(CFU)值作為腐敗評價指標，分析不同腐敗菌的致腐能力，得到在4 ℃貯藏條件下的優(yōu)勢腐敗菌，為中國對蝦腐敗機理的探索和保鮮劑開發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

中國對蝦（鮮活，大小均勻，遼寧省錦州市水產(chǎn)品市場）；蛋白胨、牛肉膏、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（Plate count agar，PCA，北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；細菌生化鑒定管（青島海博生物技術(shù)有限公司）；甲基紅指示劑（天津市致遠化學試劑有限公司）；氧化鎂（天津市科密歐化學試劑有限公司）；氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；無水乙醇（天津市巴斯夫化工有限公司）。

立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；PZHJH-112型垂直流超凈工作臺（上海智誠分析儀器制造有限公司）；HS-25臺式酸度計（上海雷磁儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌落的分離和純化

將中國對蝦在新鮮活體的狀態(tài)下使用冰水混合致死，于4 ℃條件下貯藏中國對蝦到達腐敗末期（12 d）。參考Tshabalala等[4]方法采用10倍稀釋法，在紫外超凈臺的無菌條件下將完全腐敗的蝦肉放入0.85%無菌生理鹽水中，混勻制成菌懸液，選擇合適的梯度將菌液涂布于PCA，30 ℃培養(yǎng)48 h，計算各平板的細菌菌落總數(shù)，根據(jù)菌落表面特征形態(tài)進行分組，對各細菌進行初步歸類，并計算同一類的菌落所占比例。挑取高比例且形態(tài)特征不同的菌落進一步平板劃線分離純化，最終純化的菌株保存于試管斜面培養(yǎng)基上，備用。

1.2.2 腐敗菌的表面特征和生理生化試驗鑒定

對腐敗菌的單菌落的顏色、光澤、透明度等形態(tài)觀察和生理生化特征進行鑒定，參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[5]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[6]中關(guān)于細菌的鑒定以及生化試驗具體方法參考《現(xiàn)代細菌學培養(yǎng)基和生化試驗手冊》[7]。

1.2.3 16S rDNA鑒定和序列分析

PCR擴增，通用引物為27 f/1 492 r，擴增條件：94 ℃預變性3 min連續(xù)變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個循環(huán)，72 ℃最后延伸10 mim；擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴增和測序送往北京美優(yōu)安諾生物科技有限公司完成，用NCBI進行分析，選取同源性超過98%的序列，采用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 優(yōu)勢腐敗菌致腐能力定量測定

1.2.4.1 腐敗菌菌懸液制備

將分離得到的不同腐敗菌株在營養(yǎng)瓊脂上劃線復壯后，進行活化。參考于淑池等[8]的方法，進行改動，將活化后的菌液放置在30 ℃的立式恒溫搖床培養(yǎng)16 h左右，檢測菌液濃度達到108 CFU/mL左右。以離心機在12 000 r/min、30 min條件下，去上清，使用無菌生理鹽水將沉淀稀釋到106 CFU/mL，備用。

1.2.4.2 無菌蝦肉的制備

參考唐文靜等[9]的試驗方法，將鮮活的中國對蝦冰水致死后，去掉蝦的頭和外殼，使用無菌水沖洗中國對蝦，使用75%乙醇擦拭中國對蝦體表面，將試驗樣品放在無菌工作臺里，紫外照射30 min，達到無菌的狀態(tài)。

1.2.4.3 腐敗菌接種試驗

將處理后無菌蝦肉放入制備好的各菌懸液中30 s左右，以滅菌鑷子夾出晾干，放入無菌的封口袋中，每隔3 d測1次指標。于4 ℃條件下測定菌落總數(shù)（TVC）以對數(shù)值表示，pH和揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）為腐敗指標，以未接菌液的無菌蝦肉為對照組。

1.2.4.4 pH 測定

參考GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH的測定》[10]進行pH測定，3次平行試驗。

1.2.4.5 菌落總數(shù)測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[11]進行TVC值測定，3次平行試驗。

1.2.4.6 揮發(fā)性鹽基氮測定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[12]測定TVB-N值，3次平行試驗。

1.2.4.7 腐敗能力的定量測定

對不同菌的腐敗能力進行定量分析[13]，YTVB-N/(CFU)作為評估優(yōu)勢腐敗菌腐敗能力的指標。按式（1）計算。

式中：（TVB-N）0代表TVB-N貯藏期開始的含量，mg/100 g；（TVB-N）S代表TVB-N貯藏期結(jié)束點的含量，mg/100 g；N0代表TVC貯藏期開始的含量，CFU/g；NS代表TVC貯藏期結(jié)束點的含量，CFU/g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS、Graphpad Prism 8和和Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)分析及繪圖，不同試驗均進行3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)分析

通過多次進行平板劃線分離，4 ℃冷藏下在中國對蝦完全腐敗時，經(jīng)過平板上挑選計算其占全部菌落的比例，選出4株典型腐敗細菌菌落，以數(shù)字進行編號，見圖1，形態(tài)特征見表1。

圖1 腐敗菌分離純化

由表1可知，4株腐敗菌的菌落形態(tài)大多數(shù)為圓形、凸起、光滑、整齊，只有2號菌株為非圓、扁平、粗糙、不整齊，1～2號菌落顏色為白色，3號菌株為淡黃色，4號菌株為乳白色。

表1 不同腐敗細菌的菌落形態(tài)特征

2.2 腐敗菌表面形態(tài)和生理生化試驗測定

表2為分離純化的4株菌革蘭染色及其生理生化特征。

圖2 革蘭染色結(jié)果

表2 不同腐敗細菌的生理生化特征

革蘭染色結(jié)果表明2號菌株為陽性，1號，3號和4號菌株為陰性；觸酶試驗只有4號菌株為陰性，山梨醇發(fā)酵試驗都為陽性；氧化酶試驗1號菌株和3號菌株呈現(xiàn)陽性、2號菌株和4號菌株為陰性；硫化氫試驗2號菌株為陽性，1號，3號、4號菌株陰性；L-精氨酸脫羧酶試驗只有4號菌株為陰性；O/F試驗1號菌株和3號菌株為產(chǎn)堿型，2號菌株和4號菌株為發(fā)酵型；明膠液化試驗除3號菌株外都是陰性。

2.3 16S rDNA鑒定及同源性分析

2.3.1 4菌株P(guān)CR產(chǎn)物的凝膠電泳圖像

采用27F/1492R通用引物，對4株冷藏中國對蝦腐敗菌的基因組DNA進行PCR擴增，16S rDNA擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1 500 bp大小的特異條帶，如電泳圖3所示。

圖3 4株腐敗細菌的16S rDNA電泳圖譜

2.3.2 16S rDNA序列的同源性分析

將冷藏條件下，篩選出中國對蝦貯藏末期的4株優(yōu)勢腐敗菌送到北京美優(yōu)安諾生物科技有限公司測序，利用NCBI進行分析，選取同源性≥98%的菌株序列，進行多重菌株序列比較對比構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，見圖4所示。

由圖4結(jié)合菌株形態(tài)及生理生化試驗可得出結(jié)果，1號菌株為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、2號菌株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、3號菌株為腐敗希瓦菌（Shewanella putrefaciens）、4號菌株為威斯康星米勒菌（Moellerella wisconsensis）。

圖4 基于16S rDNA序列同源性的中國對蝦4株腐敗菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

試驗與前人研究大致相似，如Wang等[14]在腐敗的冷鮮雞中分離鑒定得到4株優(yōu)勢腐敗菌：殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）和液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）。張振[15]研究冷藏中國對蝦0～12 d不同貯藏節(jié)點的腐敗菌，共分離得到10株細菌，通過菌相分析，得出在12 d冷藏末期的優(yōu)勢菌為Pseudomonasspp和Shewanellaspp。

2.4 優(yōu)勢腐敗菌的致腐能力分析

2.4.1 pH變化

將4株優(yōu)勢腐敗菌接種于無菌蝦肉后，中國對蝦冷藏期間的pH的變化結(jié)果見表3，編號依次為J（熒光假單胞菌）、F（腐敗希瓦菌）、W（威斯康星米勒菌）、D（地衣芽孢桿菌）、C（對照），下同。

如表3所示，不同組別在第0天時pH在6.57～6.68，在冷藏第3天的pH呈現(xiàn)降低趨勢，到達第6天，隨著冷藏天數(shù)延長，pH呈現(xiàn)逐漸上升趨勢。原因是水產(chǎn)品死后，乳酸在體內(nèi)累積導致pH降低，體內(nèi)的蛋白質(zhì)開始逐步分解，由此產(chǎn)生大量的含氮物質(zhì)導致pH上升[16]。只有C組和F組在pH延緩至第6天有上升趨勢，但各組在冷藏期間都呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，從表3可以看出，J組在第12天時，pH顯著高于其他組，存在顯著性差異（P＜0.05），說明假單胞菌屬對分解中國對蝦蛋白質(zhì)產(chǎn)生更多氨類物質(zhì)的能力更強。其次是F組。假單胞菌屬腐敗能力更強與陳冬霞[17]研究結(jié)果相符。

表3 不同菌株對中國對蝦冷藏期間pH變化的影響

2.4.2 菌落總數(shù)變化

接種不同腐敗菌后中國對蝦在冷藏條件下，TVC值的變化如圖5所示，隨著貯藏天數(shù)增加，各組別的TVC值均呈整體上升趨勢。C組在第12天時TVC值達到6.08 lg（CFU/g）已超出安全范圍，水產(chǎn)品的最高安全限制數(shù)值為6.0 lg（CFU/g）[18]，J組在第6天超出安全限值，代表已不可食用。其J組至9 d時TVC值達到6.76 lg（CFU/g），顯著高于其他組，存在顯著性差異（P＜0.05），第12天的J組與F組的TVC值顯著高于其他組，存在顯著性差異（P＜0.05），J組與F組在第6天增長加快，隨著冷藏時間的延長，在12 d時J組與F組TVC值不存在顯著性差異（P＞0.05）。說明熒光假單胞菌與腐敗希瓦菌生長繁殖能力強，是造成中國對蝦腐敗變質(zhì)的主要菌群。這一結(jié)論與楊賓等[19]研究大菱鲆優(yōu)勢腐敗菌為假單胞菌屬和腐敗希瓦菌一致。

圖5 不同菌株對中國對蝦冷藏期間TVC值變化的影響

2.4.3 TVB-N變化

TVB-N值是評價水產(chǎn)品品質(zhì)的相應指標，參考GB/T 18108—2019《鮮海水魚通則》[20]，水產(chǎn)品的TVB-N值＞30 mg/100 g，即為腐敗變質(zhì)。接種不同腐敗菌后中國對蝦在冷藏條件下，隨著時間延長的TVB-N值的變化見圖6。

圖6 不同菌株對中國對蝦冷藏期間TVB-N值變化的影響

由圖6可知，所有接菌組的TVB-N值整體高于對照組，在0～12 d冷藏期內(nèi)，不同組別的TVB-N值均呈上升趨勢，且各組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。前3 d，所有組的TVB-N值總體緩慢增加，組間TVB-N值差異不顯著，第3天各組之間上升趨勢加快，且存在顯著性差異（P＜0.05）。第6天時，對照組TVB-N值為14.7 mg/100 g，為一級鮮度，各接菌組TVB-N值均已超過30 mg/100 g，蝦肉已腐敗變質(zhì)，冷藏至12 d時J組TVB-N值達到87.75±1.07 mg/100 g，與其他組存在顯著性差異（P＜0.05），J組腐敗能力更強。Stohr等[21]研究表明，Pseudomonasspp.接種在無菌煙熏蛙魚表現(xiàn)出產(chǎn)TVB-N能力較強。

2.4.4 腐敗能力的定量測定

不同腐敗菌的營養(yǎng)生長條件不同，使代謝能力會產(chǎn)生不同，通過計算產(chǎn)量因子，測定4株腐敗菌的致腐能力。

由圖7可知，以TVB-N產(chǎn)量因子得到的數(shù)據(jù)為依據(jù)，確定不同菌株致腐能力的大?。篔組＞F組＞W(wǎng)組＞D組。J組的產(chǎn)量因子為（1.22±0.06）×10-6mg TVB-N/CFU，高于其他組別有顯著性差異（P＜ 0.05），由此可以初步得出熒光假單胞菌為4 ℃冷藏中國對蝦的SSO。候溫甫等[22]研究表明假單胞菌屬是草魚4 ℃貯藏末期的優(yōu)勢腐敗菌。曹榮等[23]利用高通量測序技術(shù)，表明凡納濱對蝦在4 ℃冷藏下的優(yōu)勢菌群為假單胞菌屬一直占高比例。試驗結(jié)果與其他研究結(jié)果大致相同，一些菌種的不同和致腐能力不同可能與水產(chǎn)品品種不同有關(guān)。

3 結(jié)論

通過培養(yǎng)基法從4 ℃冷藏下的中國對蝦腐敗的末期（12 d），分離純化獲得4株腐敗菌，結(jié)合生理生化指標和16S rDNA技術(shù)鑒定，分別屬于熒光假單胞菌、威斯康星米勒菌、腐敗希瓦菌、地衣芽孢桿菌。對4株腐敗菌進行致腐能力測定，熒光假單胞菌的致腐能力最高，其次是腐敗希瓦菌，地衣芽孢桿菌和威斯康星米勒菌最弱。確定熒光假單胞菌為4 ℃冷藏中國對蝦的優(yōu)勢腐敗菌，通過篩選致腐能力最強的優(yōu)勢腐敗菌，可為后續(xù)針對性抑菌試驗和保鮮劑的選擇提供理論參考。