王寅，劉雪梅，徐葉，趙利，白春清

江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（南昌 330013）

薏苡仁油（Coix seed oil，CSO）是薏苡仁或薏苡仁加工副產(chǎn)物麩皮中提取出的油脂或脂溶性功能成分混合物[1]。CSO中有薏苡仁酯、薏苡仁素、生育酚等功能成分，其中薏苡仁酯是CSO中不飽和脂肪酸2，3-丁二醇的總稱，對(duì)抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡具有積極作用。β-胡蘿卜素是一種脂溶性的天然色素，具有一定的抗氧化活性[1]，但在光、熱等條件下極不穩(wěn)定。為增強(qiáng)β-胡蘿卜素-薏苡仁油體系的穩(wěn)定性，此次試驗(yàn)采用脂質(zhì)體包埋技術(shù)將其包裹。

脂質(zhì)體是由脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成的封閉囊泡[2]，具有類似細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，能夠包埋水溶性、油溶性以及兩親性活性物質(zhì)，在活性物質(zhì)包埋方面應(yīng)用廣泛[3]。但因膜材自身組成易于氧化，外界胃腸道消化穩(wěn)定性欠佳等問題，脂質(zhì)體并不適用于直接口服食用[4-5]。聚合物具有較好的生物相容性和生物可降解性。研究表明采用聚合物對(duì)其表面進(jìn)行修飾，可解決脂質(zhì)體的上述缺陷。殼聚糖作為唯一的聚陽(yáng)離子多糖[6]，因其具有較好的抗菌性、生物相容性、生物降解性、低毒性、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，是應(yīng)用最廣泛、最有前途的脂質(zhì)體表面修飾聚合物[7-8]。果膠是從高等植物細(xì)胞壁中層提取的具有生物相容性陰離子多糖類聚合物[9-10]，因無(wú)毒無(wú)害且具有凝膠特性，在食品和藥品中發(fā)揮越來越重要的角色。有研究表明，利用聚合物間的異電性，采用改進(jìn)的制備技術(shù)，可在脂質(zhì)體表面進(jìn)行雙層甚至多層修飾以提高穩(wěn)定性。Liu等[11]利用層層自組裝技術(shù)制備了殼聚糖和海藻酸鹽雙層修飾的脂質(zhì)體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單層修飾脂質(zhì)體、常規(guī)脂質(zhì)體相比，雙層修飾脂質(zhì)體具有更高的物化穩(wěn)定性和體外消化穩(wěn)定性。課題組前期也曾采用聚電解質(zhì)絡(luò)合技術(shù)，利于果膠、殼聚糖的異電性構(gòu)建了果膠、殼聚糖雙層修飾脂質(zhì)體，對(duì)其工藝要求、結(jié)構(gòu)特性及形成機(jī)制、消化利用情況等進(jìn)行了系統(tǒng)研究[12]，但其作為新型載體在常規(guī)食品加工或貯藏條件下的穩(wěn)定性未進(jìn)行評(píng)價(jià)。

因此，此次試驗(yàn)以粒徑、電位為主要指標(biāo)對(duì)常規(guī)脂質(zhì)體、殼聚糖單層修飾脂質(zhì)體和果膠-殼聚糖雙層修飾脂質(zhì)體三種不同類型脂質(zhì)體的溫度穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性進(jìn)行深入研究，為聚合物修飾脂質(zhì)體的開發(fā)以及脂質(zhì)體的工業(yè)化應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（Solarbio公司）；果膠（Sigma-Aldrich公司）；蛋黃卵磷脂（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；薏苡仁油（廣州合誠(chéng)三先生物科技公司）；膽固醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；上述所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

N-1100旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）；Nicomp 380微粒粒度分析儀（上海奧法美嘉公司）；ZetaCAD Zeta電位測(cè)定儀[儀思奇（北京）科技發(fā)展有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)脂質(zhì)體的制備

采用乙醇注入法制備常規(guī)脂質(zhì)體，將蛋黃卵磷脂、膽固醇（質(zhì)量比5∶1）及6 mg薏苡仁油完全溶解于10 mL的無(wú)水乙醇中，得到油相。準(zhǔn)確量取25 mL磷酸鹽緩沖液，于磁力攪拌器加熱至45 ℃得水相，然后用滴管分?jǐn)?shù)次將油相滴入水相中，繼續(xù)恒溫?cái)嚢?0 min。接著將其于45 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇形成薄膜，至溶液無(wú)氣泡產(chǎn)生，繼續(xù)蒸發(fā)15 min，測(cè)定體積并補(bǔ)加蒸餾水至25 mL，得到常規(guī)脂質(zhì)體。

1.3.2 殼聚糖修飾脂質(zhì)體的制備

將常規(guī)脂質(zhì)體按照體積比1∶ 1緩慢滴入至殼聚糖乙酸溶液（0.2%wt）中，滴完后繼續(xù)攪拌20 min，得到殼聚糖修飾脂質(zhì)體（制備過程中保持室溫磁力攪拌狀態(tài)）。

1.3.3 果膠-殼聚糖修飾脂質(zhì)體的制備

將羧甲基殼聚糖修飾脂質(zhì)體按照體積比1∶1緩慢滴入果膠磷酸鹽溶液（0.06%）中，滴完后繼續(xù)攪拌20 min得到果膠-殼聚糖修飾脂質(zhì)體（制備過程中保持室溫磁力攪拌狀態(tài)）。

1.3.4 溫度穩(wěn)定性考察

將上述3種樣品分裝于小試管中（每支試管3 mL），分別于60，70，80，90和100 ℃加熱30 min，水浴加熱完成后取出，并立即放入冷水中，冷卻至室溫。另取上述3種樣品，分別置于80 ℃水浴加熱5，15，30，45和60 min后，立即放入冷水中冷卻，分別測(cè)定3種脂質(zhì)體的電位、粒徑大小及分布，考察產(chǎn)品的溫度穩(wěn)定性。

1.3.5 冷凍穩(wěn)定性考察

將上述3種樣品，按每支試管10 mL，分裝于小試管中，放冰箱冷凍24 h后，用冷水解凍后，繼續(xù)放入冰箱冷凍，測(cè)定樣品分別經(jīng)過1～5次循環(huán)冷凍后的電位、粒徑大小及分布，考察產(chǎn)品的冷凍穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 23.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析，用Microsoft Excel 2010處理并繪制圖表，小寫字母（a，b，c，d和e）表示同一脂質(zhì)體在不同條件下的差異性，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度穩(wěn)定性研究

熱處理是幾乎所有液態(tài)食品走向市場(chǎng)前必須經(jīng)歷的關(guān)鍵加工工序。熱處理可破壞病原微生物、降低腐敗微生物數(shù)量，達(dá)到延長(zhǎng)食品保質(zhì)期的目的。但在熱處理過程中，也會(huì)對(duì)食品的感官產(chǎn)生影響，如降低液態(tài)食品的穩(wěn)定性，產(chǎn)生聚集、沉淀等現(xiàn)象，產(chǎn)生不良風(fēng)味，從而影響消費(fèi)者的感官可接受度。此次試驗(yàn)以粒徑、電位為主要指標(biāo)，系統(tǒng)研究了3種脂質(zhì)體不同加熱溫度、加熱時(shí)間下的穩(wěn)定性，為脂質(zhì)體的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

比較新鮮制備的3種脂質(zhì)發(fā)現(xiàn)，常規(guī)脂質(zhì)體經(jīng)聚合物修飾后，粒徑大小和表面電荷都發(fā)生一定程度的改變。推測(cè)可能是由于殼聚糖在醋酸溶液中帶大量正電荷，當(dāng)其與帶負(fù)電的脂質(zhì)體接觸時(shí)，通過靜電吸附作用發(fā)生結(jié)合，在脂質(zhì)體表面形成一層保護(hù)層，在增大其粒徑的同時(shí)，中和脂質(zhì)體表面原有的負(fù)電荷，使其帶一定量的正電荷[13]。果膠再次修飾后的P-C-L的平均粒徑為306.25±0.8 nm，電位值為28.41±0.61 mV，這可能是帶負(fù)電荷的果膠通過靜電相互作用與殼聚糖發(fā)生絡(luò)合，一方面中和了C-L上的部分正電荷，降低了粒子的帶電性，另一方面由于相互結(jié)合使殼聚糖層致密，而使其粒徑略微降低[14-15]。

同種脂質(zhì)體不同溫度加熱處理的比較分析結(jié)果顯示，隨著加熱溫度的升高，3種脂質(zhì)體的平均粒徑均有不同程度的增加。其中：L經(jīng)60～80 ℃加熱處理后，粒徑變化不大，不同處理溫度間不存在顯著性差異；但經(jīng)90～100 ℃加熱處理后粒徑有所升高。對(duì)于C-L樣品，60，70和80 ℃加熱處理組間不存在顯著性差異，≥90 ℃加熱處理可使其粒徑有所增加，且加熱溫度越高，粒徑增大幅度越大。而不同溫度加熱處理對(duì)P-C-L的粒徑影響較大，≤70 ℃加熱處理對(duì)其粒徑影響較小，而高溫加熱（≥80 ℃）將引起P-C-L粒徑增大，且粒徑大小與溫度高低呈正相關(guān)。綜上，3種脂質(zhì)體的粒徑熱穩(wěn)定性為L(zhǎng)＞C-L＞P-C-L。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，修飾脂質(zhì)體的形成機(jī)制主要為靜電相互作用及氫鍵相互作用，皆為非共價(jià)相互作用，修飾層與脂質(zhì)體間及修飾層間結(jié)合力較弱。較高溫度的處理可能會(huì)破壞修飾層間及修飾層與脂質(zhì)體間的相互作用，使修飾層較為松散，而引起粒徑增大[16]。

Zeta電位的絕對(duì)值和懸著液的穩(wěn)定程度密切相關(guān)，一般來說，Zeta電位絕對(duì)值越大，微粒間排斥力越大，可有效抵抗粒子間的聚集，提高體系的穩(wěn)定性；相反，體系的Zeta電位數(shù)值越低，粒子之間的吸引力越大，粒子間容易出現(xiàn)聚集，甚至產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象，體系穩(wěn)定性較小[17]。

圖2為不同溫度加熱30 min后樣品的Zeta電位值變化情況。結(jié)果顯示，經(jīng)不同溫度處理3種脂質(zhì)體的電位值雖有起伏，但差異不大，即加熱并未改變粒子的表面電位大小。

圖2 脂質(zhì)體經(jīng)不同溫度加熱30 min后的平均電位

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性，此次試驗(yàn)考察了80 ℃水浴加熱不同時(shí)間（5，15，30，45和60 min）對(duì)3種脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，L和C-L的平均粒徑在整個(gè)加熱時(shí)間范圍內(nèi)變化不大，相同樣品在不同時(shí)間不存在顯著性差異。加熱處理會(huì)使P-C-L粒徑顯著提高。圖3顯示，加熱5 min后其粒徑比未加熱前增大75 nm，但在加熱30 min內(nèi)樣品的粒徑間差異不顯著。當(dāng)加熱時(shí)間延長(zhǎng)至45 min時(shí)，粒徑有所降低，而更長(zhǎng)時(shí)間的加熱（60 min）可能引起P-C-L修飾層松散程度較為嚴(yán)重，而導(dǎo)致平均粒徑大幅度升高。

圖3 脂質(zhì)體經(jīng)80 ℃加熱不同時(shí)間后的平均粒徑

從圖4可以看出，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，3種脂質(zhì)體的Zeta電位均出現(xiàn)一定的起伏，但差異性不大，與新制備的樣品相比也基本無(wú)差異。綜合粒徑結(jié)果可得知，L和C-L的80 ℃熱穩(wěn)定性較好，但熱處理會(huì)引起修飾層松緊性改變而導(dǎo)致P-C-L粒徑整體增大，但并未引起P-C-L粒子間的聚集及結(jié)構(gòu)的改變。

圖4 脂質(zhì)體經(jīng)80 ℃加熱不同時(shí)間后的平均電位

2.2 冷凍穩(wěn)定性

從圖5可發(fā)現(xiàn)，凍融處理會(huì)引起脂質(zhì)體粒徑增大。經(jīng)過第1次凍融后，L和C-L的粒徑與新鮮樣品差異不大，但P-C-L的平均粒徑顯著增大，其外觀則從澄清的淡黃色液體變?yōu)辄S色懸濁液，并出現(xiàn)明顯的沉淀聚集物。隨著凍融次數(shù)的增加，所有樣品的粒徑都有所增大，其中以C-L樣品增速最為緩慢，經(jīng)過5次凍融處理后，粒徑增大87 nm；對(duì)于常規(guī)脂質(zhì)體，2～4次凍融處理后樣品間不存在顯著性差異，經(jīng)過5次凍融處理后平均粒徑增至（324±1.7）nm，比新制備樣品增大177 nm；而P-C-L隨著凍融處理次數(shù)的增加，聚集沉淀程度加劇，甚至高達(dá)21 μm，不適于進(jìn)行粒徑的測(cè)定，因此圖5未顯示。

圖5 脂質(zhì)體樣品在反復(fù)凍融下的平均粒徑

電位結(jié)果如圖6所示。經(jīng)過一次凍融處理后，C-L和P-C-L的電位值顯著降低，反復(fù)多次凍融對(duì)C-L的電位值影響較小，P-C-L的電位雖有波動(dòng)，但不存在顯著性差異。對(duì)于修飾脂質(zhì)體，聚合物間以及聚合物與脂質(zhì)體間的相互作用源于靜電相互作用、氫鍵相互作用，都屬于非共價(jià)相互作用，結(jié)合力較弱。外加試驗(yàn)所采用的冷凍過程為慢速凍結(jié)，冰晶形成過程較慢，在冰峰由外向內(nèi)遷移過程中破壞了修飾層間以及修飾層與脂質(zhì)體表面的相互作用，導(dǎo)致修飾層脫落，影響了粒子的界面電位[18]。

圖6 脂質(zhì)體樣品在反復(fù)凍融下的平均電位

2.3 pH穩(wěn)定性

經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)新制備的常規(guī)脂質(zhì)體pH接近中性，而兩種修飾脂質(zhì)體的pH呈酸性。調(diào)整體系pH后，3種脂質(zhì)體樣品的平均粒徑和電位值如圖7和圖8所示。常規(guī)脂質(zhì)體的平均粒徑受pH的影響較小，而pH變化對(duì)C-L及P-C-L的粒徑大小影響較大，C-L的粒徑在pH 7時(shí)快速增加到893.9±10.4 nm。P-C-L的平均粒徑在不同pH條件下差異顯著，其中以pH 7時(shí)粒徑最大（P＜ 0.05）。在整個(gè)pH區(qū)間，L的粒徑的變化較小。有研究表明脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)受pH變化的影響較小，幾乎不會(huì)被破壞，這可能是由于脂質(zhì)體中的磷脂和膽固醇自身的結(jié)構(gòu)特性以及它們之間通過氫鍵結(jié)合的方式，在一定程度上維持了脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，pH的改變對(duì)其結(jié)構(gòu)基本不造成破壞[16]。

圖7 脂質(zhì)體樣品在不同pH下的平均粒徑

圖8 脂質(zhì)體樣品在不同pH下的平均電位

而對(duì)于修飾脂質(zhì)體而言，C-L的形成主要是利用殼聚糖分子中帶正電荷的氨基與磷脂分子中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)之間的靜電相互作用產(chǎn)生；而P-C-L則再由帶負(fù)電果膠分子中的羧基與帶正電殼聚糖中的氨基通過氫鍵及靜電相互作用實(shí)現(xiàn)[19]。殼聚糖作為一種陽(yáng)離子的多糖，在低pH條件下易溶解，且?guī)д姾?，但?dāng)pH大于5時(shí)，則溶解性下降，甚至沉淀析出；果膠作為一種陰離子多糖，分子中的羧基電離后帶一定量的負(fù)電荷，在堿性環(huán)境下具有較高的溶解度，但在酸性條件下易于析出，pH的改變會(huì)影響二者的帶電性和溶解性，從而影響二者以及殼聚糖與脂質(zhì)體間的相互作用，進(jìn)而影響修飾脂質(zhì)體的修飾層的緊密度及粒徑大小。調(diào)節(jié)pH后，常規(guī)脂質(zhì)體的表面帶電狀態(tài)發(fā)生了變化，加劇了脂質(zhì)體體系的不穩(wěn)定，常規(guī)脂質(zhì)體樣品的表面電荷絕對(duì)值變小，兩種修飾脂質(zhì)體樣品的平均粒徑和Zeta電位也劇烈變化。尤其是在pH 5以后，修飾脂質(zhì)體的粒徑明顯升高，可能是調(diào)節(jié)pH后，在pH 7的條件下殼聚糖和果膠的之間的靜電相互作用會(huì)因?yàn)闅ぞ厶堑娜芙舛认陆瞪踔脸恋砦龀龆內(nèi)?，使修飾脂質(zhì)體相互粘結(jié)聚集，粒徑變大。而在pH 3的條件下，P-C-L粒徑增大，可能與果膠的溶解度下降有關(guān)。

3種脂質(zhì)體在pH 7條件下的貯藏穩(wěn)定性結(jié)果如圖9和圖10所示。可以看出，隨著貯藏時(shí)間的增加，3種脂質(zhì)體的粒徑均有不同程度的增大。L的粒徑在37 ℃ pH 7的條件下1～3 d內(nèi)無(wú)明顯增加，但在第6天增幅明顯，并出現(xiàn)顯著性差異；在6～15 d內(nèi)粒徑有一定程度的改變，但隨著貯藏時(shí)間的增加，粒徑并沒有顯著性差異。推測(cè)可能是儲(chǔ)藏期間，在較高溫度下，磷脂分子的動(dòng)能增大，脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性增強(qiáng)，體系發(fā)生了粒子的聚集或融合現(xiàn)象，導(dǎo)致粒徑增大。C-L的粒徑隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著性升高現(xiàn)象，并伴隨電位持續(xù)性降低，說明在37 ℃ pH 7的條件下C-L的穩(wěn)定性較差。P-C-L的粒徑在6～9 d時(shí)顯著增大，但在＞9 d時(shí)，未表現(xiàn)出顯著性差異。圖10顯示，在整個(gè)貯藏期，3種脂質(zhì)體的電位雖有波動(dòng)，但差異性不顯著，且呈整體下降趨勢(shì)，分析原因可能是3種脂質(zhì)體中的主要膜材磷脂易于氧化，37 ℃下產(chǎn)生的酸性氧化產(chǎn)物吸附在粒子表面，提高了其電負(fù)性。有研究報(bào)道殼聚糖具有抗氧化活性，且殼聚糖修飾可以提高脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性[20]，但因試驗(yàn)是在pH 7環(huán)境條件下，殼聚糖溶解性低引起的P-C-L及C-L失穩(wěn)，導(dǎo)致其對(duì)體系的維穩(wěn)方面未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。3種脂質(zhì)體在不同pH條件下的貯藏穩(wěn)定性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖1 脂質(zhì)體經(jīng)不同溫度加熱處理30 min后的平均粒徑

圖9 脂質(zhì)體樣品在37 ℃，pH 7下貯藏15 d的平均粒徑

圖10 脂質(zhì)體樣品在37 ℃，pH 7下貯藏15 d的平均電位

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)以平均粒徑及Zeta電位為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)常規(guī)脂質(zhì)體、殼聚糖修飾脂質(zhì)體和果膠-殼聚糖多層修飾脂質(zhì)體的溫度穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性以及pH穩(wěn)定性進(jìn)行了系統(tǒng)考察。結(jié)果表明：常規(guī)脂質(zhì)、殼聚糖修飾脂質(zhì)體具有較好的熱穩(wěn)定性，能耐80 ℃長(zhǎng)時(shí)間加熱，而果膠-殼聚糖修飾脂質(zhì)體的耐受溫度較低，高溫加熱易引起粒徑變大，但未改變其結(jié)構(gòu)特性；殼聚糖修飾脂質(zhì)體具有最佳的凍融穩(wěn)定性，其次為常規(guī)脂質(zhì)體；常規(guī)脂質(zhì)體的pH穩(wěn)定性優(yōu)于修飾脂質(zhì)體，pH的改變會(huì)影響聚合物的溶解度，從而改變其聚合物修飾的粒徑大小及界面電位，修飾脂質(zhì)體在37 ℃ pH 7的條件下貯藏穩(wěn)定性較差。