隋秀奇，劉 聰，王義偉，王文梅，顧雨非，王厚臣

（1 煙臺現(xiàn)代果業(yè)科學研究院，山東 264003）

（2 諸城市林業(yè)發(fā)展中心）

（3 諸城市桃林鎮(zhèn)三區(qū)共建服務中心）

煙富8 是煙臺現(xiàn)代果業(yè)科學研究院從煙富3 蘋果芽變中選育的濃紅型品種，2018 年獲得植物新品種權，大果，高樁，表光好，星點?。恢?，弱光即可著色，上色快，著色全面[1]；果肉黃色，品質(zhì)好；硬度高，耐貯性好，在全國已大面積推廣。

M9T337 是從M9 組培苗中選育出的蘋果矮化砧，嫁接品種后結果早、干性強、易成花，對土壤和氣候適應性廣，是目前推廣的主流矮化砧[2]。

八棱海棠根系深廣，與蘋果樹嫁接親和力好，適應性和抗逆性均強[3]，耐干旱和濕澇，還有耐鹽堿[4]、豐產(chǎn)性好等優(yōu)點，是目前主要的蘋果喬化砧[5]。

蘋果樹一旦感染病毒病，終生不愈，并且具有傳染性。病毒侵染后，蘋果樹生長量減小，產(chǎn)量銳減，品質(zhì)變劣，需肥量增加，但是肥效很差。我國當前已經(jīng)鑒定明確的有17 種蘋果病毒，其中6 種屬于重點檢測對象[6-7]，分別是蘋果銹果類病毒（ASSV）、蘋果綠皺果類病毒（AgrCV）、蘋果花葉病毒（ApMV）3 種非潛隱性病毒[8]和蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果莖痘病毒（ASPV）和蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）3 種潛隱性病毒。潛隱性病毒侵染蘋果樹后，一般不表現(xiàn)典型癥狀，外觀上不易識別，但造成樹勢衰弱、產(chǎn)量下降等問題[9]。蘋果非潛隱性病毒通常在蘋果栽培品種上都能表現(xiàn)出典型的癥狀，容易識別，對樹體危害很大[10]。目前還沒有完全有效的藥劑抑制病毒病的發(fā)生。加快優(yōu)良品種無病毒苗木的繁育與推廣，實現(xiàn)蘋果無毒化栽培是防治病毒病的根本途徑，也是我國蘋果產(chǎn)區(qū)亟待解決的問題[11]。

1 無毒組培苗的獲取

1.1 試驗材料

蘋果砧木品種M9T337、八棱海棠和蘋果品種煙富8 均取自煙臺現(xiàn)代果業(yè)有限公司試驗基地。

蔗糖、無水乙醇、瓊脂等藥品及6-BA（6-芐氨基嘌呤）、IBA（吲哚丁酸）等植物生長調(diào)節(jié)劑均購自濟南東宙?zhèn)I(yè)化工有限公司，均為分析純。

所用的基本培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基，根據(jù)不同環(huán)節(jié)的要求，附加不同的植物生長調(diào)節(jié)劑，再加3%的蔗糖、0.7%的瓊脂，pH 值調(diào)整為5.8。用圓形玻璃組培瓶分裝，每瓶分裝40 mL，在1 kg/cm2壓力下高溫滅菌20 min。然后在植物組織培養(yǎng)接種室內(nèi)接種，再將接種好的外植體放在溫度為（26±1）℃、光強1 000 lx、光照12 h/d 的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

（1）取樣與消毒。生長季節(jié)分別提取M9T337、八棱海棠和煙富8 的正在生長的嫩梢，取前端5 cm，進行消毒處理后，放到盛有MS 營養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶內(nèi)讓其生長，然后采頂芽進行取樣消毒接種。

（2）莖尖培養(yǎng)建立無菌體系。當培養(yǎng)瓶內(nèi)的芽抽生出1.0 cm 左右時，移至超凈工作臺上，從新梢上剪取頂端嫩芽，浸入到75%酒精中消毒8 s，然后取出在滅菌水下沖洗3～4 次，放置在無菌濾紙上吸干水分，再在0.1%的升汞液中消毒8～12 min，再用無菌水沖洗3～5 次，在無菌紙上吸干水分后，接種在配制好的培養(yǎng)基中，在植物組織培養(yǎng)室內(nèi)進行無菌培養(yǎng)。M9T337、八棱海棠和煙富8 培養(yǎng)基用MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA＋7 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖。

（3）剝?nèi)∏o尖初脫毒。20 d 后，在超凈工作臺上，用解剖刀剝離無菌組培苗幼葉至裸露的生長點，切下帶1～2 個葉原基的生長點（基本不帶毒），轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基用MS＋2.0 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L IBA＋7 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖，放置在植物組織培養(yǎng)室內(nèi)進行無菌培養(yǎng)。

（4）高溫鈍化脫毒。組培苗生長到2 cm 左右時，將無菌瓶苗放在38～40 ℃的智能人工氣候箱里生長30 d 左右，使組培苗攜帶的各種病毒在高溫下逐漸鈍化，失去活性。

（5）二次莖尖剝離脫毒。對存活的經(jīng)過高溫鈍化的無菌瓶苗，進行二次莖尖剝離，得到0.2～1.0 mm 長的無毒莖尖，重新轉(zhuǎn)移到MS＋2.0 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L IBA＋7 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖的培養(yǎng)基中，在植物組織培養(yǎng)室內(nèi)進行無菌培養(yǎng)。

1.3 病毒檢測

經(jīng)過初次莖尖剝離脫毒、高溫鈍化脫毒和二次莖尖剝離脫毒的組培苗，生長到2 cm 之后，委托中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所進行病毒檢測。

2 無毒莖尖的增殖培養(yǎng)

在無菌接種室內(nèi)的超凈工作臺上，已脫毒的組培苗莖尖接種到快繁培養(yǎng)基內(nèi)進行增殖培養(yǎng)。擴繁瓶苗培養(yǎng)周期為25 d，25 d 后再分瓶接種。這種繁殖方式是在無菌、密閉的情況下進行，不會再感染外界病毒。M9T337、八棱海棠、煙富8 擴繁培養(yǎng)基為MS＋6-BA＋IBA＋7 g/L瓊脂＋30 g/L蔗糖，6-BA濃度有0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L 4 個，IBA 濃度有0.1、0.3、0.5、0.7 mg/L 4 個，進行6-BA 濃度和IBA濃度配比篩選。每個植物材料和每個濃度組合接種5 瓶，每瓶接種5 株，培養(yǎng)25 d，選取最佳濃度組合，統(tǒng)計增殖系數(shù)。

試驗發(fā)現(xiàn)，隨著6-BA 濃度的增加，增殖系數(shù)增加，但組培苗基部簇生狀明顯，部分組培苗出現(xiàn)玻璃化無用苗，確定6-BA 最佳濃度為1.5 mg/L，IBA因植物材料不同而有差異。M9T337 和八棱海棠擴繁培養(yǎng)基適宜配方為MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IBA（表1、表2），煙富8 擴繁培養(yǎng)基適宜配方為MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IBA（表3）。

表1 脫毒M9T337 增殖培養(yǎng)基中IBA 與6-BA 不同組合濃度的增殖系數(shù)

表2 脫毒八棱海棠增殖培養(yǎng)基中IBA 與6-BA 不同組合濃度的增殖系數(shù)

表3 脫毒煙富8 增殖培養(yǎng)基中IBA 與6-BA 不同組合濃度的增殖系數(shù)

試驗中發(fā)現(xiàn)，隨著6-BA 濃度的增加，增殖系數(shù)增加，但組培苗基部簇生狀明顯，部分組培苗出現(xiàn)玻璃化無用苗，針對簇生狀苗和玻璃化苗，在M9T337、八棱海棠、煙富8 擴繁培養(yǎng)基中均分別添加GA30.1、0.3、0.5、0.7 mg/L，每個濃度接種10瓶，每瓶5 株，培養(yǎng)25 d，觀察統(tǒng)計增殖培養(yǎng)組培苗高度和玻璃化苗發(fā)生率，GA3濃度以0.5 mg/L 為最佳（表4）。

表4 脫毒M9T337、八棱海棠、煙富8 增殖培養(yǎng)基中添加不同濃度GA3苗高及玻璃化苗發(fā)生情況

蘋果砧木M9T337 和八棱海棠增殖培養(yǎng)基最佳配方均為MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IBA＋0.3 mg/L GA3＋7 g/L 瓊脂+30 g/L 蔗糖，煙富8 增殖培養(yǎng)基最佳配方為MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IBA＋0.3 mg/L GA3＋7 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖。

3 無毒苗的生根培養(yǎng)

無病毒苗繁殖到一定數(shù)量后，單株接種到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基為1/2MS＋1.5 mg/L IAA＋0.15 mg/L IBA＋5.3 g/L 瓊脂＋20 g/L 蔗糖，pH 值5.8[7]，M9T337、八棱海棠和煙富8 的生根數(shù)和生根長度均很好。

生根瓶苗在無菌培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)15～18 d，根長到1 cm 左右，完成生根培養(yǎng)。

4 無毒苗的溫室馴化

經(jīng)過生根的脫毒苗，轉(zhuǎn)移到溫室，先帶蓋馴化鍛煉7 d，再打開培養(yǎng)瓶瓶口馴化鍛煉3～5 d。馴化結束后，從瓶中取出脫毒苗，用清水洗掉培養(yǎng)基，然后在0.1%的多菌靈溶液中蘸一下，移栽到海草穴盤內(nèi)。小苗生長到4～6 片葉時，轉(zhuǎn)移到溫室外遮陽網(wǎng)下適應3～5 d，逐漸適應自然環(huán)境。

5 建立原始一代脫毒砧木、品種采穗圃

已適應自然環(huán)境的煙富8 和M9T337 穴盤苗，3月下旬至4 月下旬定植到防蟲網(wǎng)室中（防止昆蟲傳播），建立原始一代的脫毒煙富8 和M9T337 采穗圃。在圃中生長50 d 左右，苗木粗度在0.6 cm 以上，芽體成熟，就可以提供原始一代煙富8 和M9T337無毒苗木接穗。

經(jīng)過溫室馴化鍛煉的八棱海棠和M9T337 穴盤苗，3 月下旬至4 月下旬移栽到育苗圃中，分別用作培養(yǎng)喬化苗和自根砧苗的砧木。

采穗圃和育苗圃內(nèi)都采用大小行栽植，大行行距80 cm，小行行距20 cm，株距5～10 cm。

6 培育無病毒苗木

在脫毒的砧木上嫁接原始一代的脫毒接穗，生產(chǎn)的苗木即為脫毒苗木。

為了提高苗木出圃率，在肥水管理方面要做到精細管理。當幼苗長到10 cm 以上時，根系已經(jīng)有了一定的吸收能力，可以通過水肥一體化設施施肥澆水，也可隨澆水或降雨，每667 m2撒施高氮水溶肥4～5 kg。以后間隔20 d 左右追施1 次，每次每667 m2增加2 kg 左右。前期用高氮中磷低鉀肥，7—8 月追施低氮中磷高鉀水溶肥，促使苗木充實健壯。適宜的土壤田間持水量為60%～80%，根系周圍土壤手握成團不滴水為宜，降到60%以下時必須澆水，天氣干旱時，間隔7～10 d 澆1 次，遇中雨可以不澆水。多雨季節(jié)，要注意排水，防止?jié)n澇傷害幼苗。

脫毒八棱海棠和M9T337 砧木苗在苗圃生長50 d 左右，苗木基部10 cm 左右高處粗度在0.6 cm 左右時，取防蟲網(wǎng)室中原始一代煙富8 無毒苗木接穗，采用帶木質(zhì)芽接法嫁接，經(jīng)過1～2 年的生長，就培育出可出圃的脫毒喬化或矮化自根砧苗木。

脫毒的八棱海棠砧木苗在苗圃生長50 d 左右，苗木基部10 cm 左右高處粗度在0.6 cm 左右時，取防蟲網(wǎng)室中的原始一代M9T337 無毒苗木接穗，采用帶木質(zhì)芽接法嫁接。8 月底9 月初，再取防蟲網(wǎng)室中的原始一代脫毒煙富8 品種芽，在M9T337 中間砧20～25 cm 高度上嫁接，第2 年春季在M9T337中間砧嫁接芽上剪砧，第2 年秋季可育成優(yōu)質(zhì)雙脫毒矮化中間砧煙富8 蘋果苗。

7 苗圃管理注意事項

所有接穗都來自網(wǎng)室苗圃，以保證無病毒M9T337 砧木和煙富8 的純度。苗木行間采用防草布覆蓋，建議采用水肥一體化系統(tǒng)進行水肥管理。苗木嫁接前對刀剪等嫁接工具進行酒精消毒。生長期間重點防治蚜蟲和早期落葉病，絕不使用生長調(diào)節(jié)劑和除草劑。

長勢旺盛的苗木，7 月摘心，可培育成帶分枝的大苗。

8 脫毒苗果園管理注意事項

利用脫毒苗木建立的果園，在整個管理期間，要注意修剪等工具專用，使用前要嚴格用酒精浸泡或采用燒烤等方法徹底消毒，嚴禁與非脫毒苗木直接串用。因品種改良需要高接換頭的脫毒苗，應選用無病毒接穗，切不可盲目嫁接來路不明的接穗。同時，注意一次性選好品種，避免多次高接，減少傳染機會。