李琦，劉鵬，許薔，田野，呂俊峰

（山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所，山東 濟南 250100）

冠 狀 病 毒（Coronaviruses，CoV）于1937年被發(fā)現(xiàn)，分類上屬套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）正冠狀病毒亞科（Orthocoronavirinae）。冠狀病毒又分為4個屬，分別為α、β、γ和δ，各種屬感染的宿主范圍差異較大，其中，γ屬冠狀病毒主要感染雞、鴨、鵝等禽類。鴨冠狀病毒是由陳貴錢等在2012年發(fā)現(xiàn)，隨后的流行病學調(diào)查顯示該病原在鴨群中的感染率約為5%。山東省是我國養(yǎng)鴨最多的省份，僅2020年肉鴨出欄量就高達22億只，占全國肉鴨養(yǎng)殖的近40%，鴨產(chǎn)品出口占全國的70%以上。為了調(diào)查鴨冠狀病毒（Duck Coronaviruses, DCoV）的流行情況，本研究從山東各地的養(yǎng)鴨場采集樣品451份，用PCR方法進行檢測，并對所測毒株進行遺傳演化分析。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從山東各地種鴨、蛋鴨、肉鴨養(yǎng)殖場采集樣品，樣品種類包括死胚、弱雛、腸組織、棉拭子。樣品具體來源及數(shù)量見表1。

表1 樣品采集信息

1.2 主要試劑和引物

RNA提取試劑盒，購自杭州Axygen科技有限公司；One-Step RT-PCR SuperMix試劑盒，購自北京全式金生物技術有限公司。

根據(jù)GenBank中的鴨冠狀病毒序列（GenBank號：JF699752）設計引物，選取病毒1b2區(qū)域，使用Primer 5軟件設計，上游引物為5′- GGTGGTAGTTTGTATGTGAA-3′，下游引物為5′-GGATACCGCTTATAACACT-3′，擴增片段長度為764 bp。引物由擎科生物科技有限公司（青島）合成。

2 方法

2.1 樣品處理

將死胚和弱雛解剖，取直腸，與腸組織樣品進行相同處理。取直腸/腸組織樣品0.2 g于離心管中，加入1 mL生理鹽水和適量研磨珠，用組織研磨器充分研磨。將研磨液轉(zhuǎn)移至新的離心管，12 000 rpm離心5 min，取上清200 μL用于RNA提取。

將棉拭子樣品放入離心管中，加入500 μL生理鹽水，用振蕩器振蕩。將震蕩后液體轉(zhuǎn)移至新的離心管，12 000 rpm離心5 min，取200 μL用于RNA提取。

2.2 RNA提取

用RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作如下：將200 μL轉(zhuǎn)移至新的離心管，加入200 μL Buffer V-L，振蕩混勻，靜置5 min；加75 μL Buffer V-N，渦旋混勻，12 000 rpm離心5 min；將上清轉(zhuǎn)移至2 mL離心管，加300 μL異丙醇，混勻后轉(zhuǎn)移至制備管中，6 000 rpm離心1 min；棄濾液，加500 μL Buffer W1A（預先加入無水乙醇）至制備管中，室溫靜置1 min，12 000 rpm離心1 min；棄濾液，加800 μL Buffer W2至制備管中，12 000 rpm離心1 min；將制備管轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加40 μL Buffer TE，室溫靜置1 min，12 000 rpm離心1 min，保存洗脫液。

2.3 PCR檢測

以RNA為模板，用One-Step RT-PCR SuperMix試劑盒進行PCR檢測。反應體系為20 μL，包括RNA 3 μL、上、下游引物各1 μL、2×Reaction Mix 10 μL、Enzyme Mix 0.5 μL、RNase-free Water 4.5 μL。PCR反應程序為：45 ℃，30 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃ 5 min。

反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測，出現(xiàn)條帶的PCR產(chǎn)物送至擎科生物科技有限公司（青島）測序。

2.4 序列分析

從GenBank中選取禽冠狀病毒序列，用DNA Star軟件進行同源性分析，用Mega6軟件構(gòu)建進化樹。選取序列包括火雞冠狀病毒TCoV/IN-517/94株（GenBank號：GQ427175）和MG10株（EU095850），雞傳染性支氣管炎病 毒M41/Y191株（MW222181）、M41/Y83株（MW419300）以及疫苗株H52（AF352315和H120株（ON350836），鴨冠狀病毒DK2012-CoV株（KC869937）、DK/GD/27/2014（NC048214）、禽源冠狀病毒D2328/15/3/13/GH株（MZ325298）、D2334/11/2/13/CI株（MZ325299）。

3 結(jié)果

3.1 引物檢測結(jié)果

設計特異性引物擴增鴨冠狀病毒1b2基因片段，以陽性樣品進行測試，結(jié)果顯示，能夠擴增出與目的條帶大小相似的片段（764 bp）（圖1），表明所設計的引物能夠用于臨床樣品的檢測。

圖1 DCoV 陽性樣品檢測

3.2 臨床樣品檢測結(jié)果

用PCR方法對采集的451份樣品進行檢測，僅從濟寧（2份）和濰坊（1份）送檢樣品中檢測出鴨冠狀病毒，總陽性率為0.67%，其中濟寧地區(qū)的樣品陽性率為18.2%（2/11），濰坊地區(qū)的樣品陽性率為3.3%（1/30）。

3.3 冠狀病毒序列分析結(jié)果

將PCR擴增到的3個片段進行測序，分別命名為DCoV WF 01株（濰坊送檢樣品測出）以及DCoV JN 01和02株（濟寧送檢樣品測出），并與GenBank中已公布的部分冠狀病毒的1b2基因序列進行遺傳演化分析，結(jié)果顯示：DCoV WF 01株、DCoV JN 01株和DCoV JN 02株位于同一分支，具有更近的遺傳演化關系，但與其它毒株并不位于同一分支，遺傳演化關系差異明顯（圖2）。

圖2 冠狀病毒1b2基因核苷酸序列的遺傳演化分析

4 討論與結(jié)論

鴨冠狀病毒是對養(yǎng)鴨業(yè)危害較為嚴重的病原之一，掌握其在鴨群中的流行趨勢對于防控該病原具有重要意義。山東作為主要的鴨養(yǎng)殖大省，更需要對流行病的預防和控制及時采取措施。本研究從山東各地區(qū)鴨場采集樣品，用PCR方法進行檢測，旨在調(diào)查了解山東養(yǎng)鴨地區(qū)冠狀病毒的流行情況。與之前報道的冠狀病毒感染率不同，本研究所測的總體陽性率僅為0.67%，證明目前山東地區(qū)鴨場養(yǎng)殖管理水平較高，疫病的防控措施較為嚴格。結(jié)合近年來新冠肺炎疫情的存在，人員流動頻率降低以及人們對疫情防控的重視提高，也為動物疫病的減少提供了條件。

早期的流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，鴨冠狀病毒具有發(fā)病率高、陽性率高、呈地方性流行的特點。在本次樣品采集過程中，陽性樣品采集地區(qū)（濟寧和濰坊）并未出現(xiàn)冠狀病毒相關疾病，據(jù)此我們推測冠狀病毒可能發(fā)生變異。我們發(fā)現(xiàn)，分析測出的冠狀病毒的1b2基因序列，與之前發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒相比，遺傳演化關系較遠。但是，鴨冠狀病毒的致病性和傳播特點是否發(fā)生改變，還需要后續(xù)試驗進行驗證。

綜上所述，本研究對冠狀病毒在山東地區(qū)鴨群中的流行情況進行了調(diào)查，研究結(jié)果能夠為該病防控策略的調(diào)整提供數(shù)據(jù)支持。