馮育芳 邢 進 王 洪 張雪青 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院 實驗動物資源研究所，北京 100050)

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)可產(chǎn)生耐熱腸毒素，不能被高溫滅菌(121 ℃、30 min)破壞，對酸堿穩(wěn)定。食用被該菌污染的食物、水，以及與感染動物接觸，可導致人獸共患病，甚至造成死亡[1-2]。因此，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌屬于SPF級動物必要時檢測項目[3]。為了解和提高實驗動物小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測能力，本次能力驗證項目依據(jù)CNAS-CL03《能力驗證提供者認可準則》進行檢測能力驗證(NIFDC-PT-173)，以期對提升實驗動物小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測能力[4]提供參考，同時對實驗動物微生物檢測能力驗證計劃的實施提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物：SPF級雌性豚鼠2只，8周齡，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所提供【SYXK(京)2017-0012】，實驗動物福利倫理號：中檢動(福)第2021(A)007號。動物糞便采集在生物安全柜內(nèi)進行。

1.1.2菌株：本研究使用小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica, CMCC52301)，同時設置2個干擾菌；根據(jù)細菌形態(tài)和特征，選擇宋內(nèi)志賀氏菌(Shigellasonnei, CMCC51082)和大腸埃希氏菌(Escherichiacoli, CMCC44110)。3株菌均購自中國食品藥品檢定研究院中國醫(yī)學細菌保藏管理中心，使用前通過BD-Phoniex100細菌鑒定儀進行鑒定。

1.1.3試劑材料：凍干保護液由中國食品藥品檢定研究院食品化妝品所提供。培養(yǎng)基包括哥倫比亞血瓊脂基礎(OXIOD公司，CM0331B)、脫纖維羊血(北京陸橋公司，P62)、CIN-1培養(yǎng)基(海博生物，HB0269)和改良Y培養(yǎng)基(海博生物，HB0270)；生化鑒定試劑為BD陰性菌鑒定板(BD公司，448007)。

1.2 方法

1.2.1質(zhì)控樣品制備：復蘇小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、宋內(nèi)志賀氏菌和大腸桿菌，在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基進行傳代，25 ℃培養(yǎng)48 h后分別用PBS調(diào)成109CFU/mL的菌懸液備用。將80%的凍干保護液、10%的SPF豚鼠糞便(高壓滅菌后)和10%的菌懸液(109CFU/mL)震蕩混勻制成混懸液，細菌終濃度為108CFU/mL，將3種混懸液進行分裝(200 μL/管)，用冷凍干燥機制成凍干樣品。樣品采用大流水方式進行編號。

1.2.2質(zhì)控樣品均勻性試驗：在3種樣品中分別隨機抽取10管樣品，用200 μL滅菌水重懸，10倍系列稀釋至102CFU/mL，將102～104CFU/mL濃度的菌液接種改良Y瓊脂，25 ℃培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)，菌液濃度相差應低于100倍，即原始菌液濃度應在106～108CFU/mL之間。

1.2.3質(zhì)控樣品穩(wěn)定性試驗：本次能力驗證的3種質(zhì)控樣品進行穩(wěn)定性檢驗，首先對貯藏穩(wěn)定性進行檢驗，于-20 ℃、4℃、25 ℃、37 ℃保存。-20 ℃于0 、30 d時取樣，4 ℃于0、14、21、28 d取樣(25±1)℃、37 ℃于0～10 d每天取樣，參照作業(yè)指導書對上述抽取樣品進行檢驗。用200 μL滅菌水重懸將菌液接種改良Y瓊脂，25 ℃培養(yǎng)48 h，3種樣品可分別檢測出相應的細菌。同時對運輸穩(wěn)定性進行檢驗，選取不同溫度條件的城市，將樣品完全按照實際運輸要求進行包裝，分別寄往相應城市后再寄回，應能檢出相應細菌。

1.2.4參加實驗室：全國共24家實驗室參加了此次能力驗證計劃，地區(qū)分布見表1。

表1 參加實驗室地區(qū)分布Table 1 Local distribution of Laboratory

1.2.5檢測方法：本次能力驗證建議參考GB/T 14926.3—2001實驗動物耶爾森菌檢測方法。不局限于國標規(guī)定檢測方法，但要求提供原始記錄，并要求含有具體檢測信息。

1.2.6結(jié)果判定標準：3種樣品中1個為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陽性，2個為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陰性。實驗室結(jié)果與上述結(jié)果完全一致，即判定為滿意結(jié)果；實驗室結(jié)果與上述結(jié)果不一致，即判定為不滿意結(jié)果；未按時反饋結(jié)果，也判定為不滿意結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)控樣品均勻性試驗

隨機選取10套樣品用于均勻性驗證，所有樣品在相同環(huán)境下對所含細菌數(shù)量進行平板計數(shù)測定。3種樣品測定結(jié)果為：CMCC52301濃度 8.99×107～3.48×108CFU/mL，CMCC51082濃度 9.20×107～3.98×108CFU/mL。CMCC44110濃度 7.65×107～2.98×108CFU/mL。表明本次能力驗證所制備的樣品是均勻的。

2.2 質(zhì)控樣品穩(wěn)定性試驗

按照1.2.3的方法對所制備的能力驗證樣品進行溫度和運輸穩(wěn)定性測試，4 ℃存儲4周，室溫(25±1)℃和37 ℃放置10 d，3種樣品均能檢出相應細菌。運輸穩(wěn)定性檢驗證實樣品可以滿足運輸要求，并保持細菌活性。存放穩(wěn)定性和運輸穩(wěn)定性結(jié)果證明了所制備能力驗證樣品的穩(wěn)定性達到發(fā)放要求。

2.3 實驗室反饋

參加此次比對共24個實驗室，22家滿意，占實驗室總數(shù)的91.7%；2家不滿意，占實驗室總數(shù)的8.3%，其中1家未及時反饋結(jié)果，另一家將小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陰性樣品檢測為陽性。本次能力驗證不公布具體實驗室名稱，僅以實驗室代碼進行統(tǒng)計，具體結(jié)果見表2。

表2 實驗動物小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢出能力驗證結(jié)果匯總Table 2 The summarizing of the detection levels of experimental animal Yersiniaenterocolitica testing results

3 討論

CNAS-RL01: 2018《實驗室認可規(guī)則》、CNAS-RL02: 2018《能力驗證規(guī)則》規(guī)定申請認可和獲準認可的實驗室必須通過參加能力驗證活動(包括CNAS組織實施或承認的能力驗證計劃、測量審核)證明其技術能力。只有在能力驗證活動中表現(xiàn)滿意，或?qū)τ诓粷M意結(jié)果能證明已開展了有效糾正措施的實驗室，CNAS方可受理認可申請或予以認可。對參加了CNAS組織及其承認的能力驗證活動且有穩(wěn)定滿意表現(xiàn)的實驗室，在CNAS的各類評審中可考慮適當簡化相關項目的能力確認過程。實驗室應保存上述記錄以備評審組檢查。

能力驗證是實驗室檢測質(zhì)量監(jiān)控的重要手段，既是實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制的補充，又是政府和社會了解實驗室檢測能力的重要方法[5]。能力驗證作為日常監(jiān)督檢查的輔助手段，能夠有效提升實驗室的檢測能力。促進實驗室保持有效的檢測能力，同時也幫助部分實驗室及時發(fā)現(xiàn)自身的不足并加以改進，為更好地檢測實驗動物提供有力的技術支撐[6-7]。本項目研究，包括小腸結(jié)腸炎耶爾森菌能力驗證樣品的制備、評價方案的制定以及能力驗證結(jié)果的匯總分析，評價參加單位實驗動物致病菌的檢測能力，驗證計劃的組織和實施工作。

根據(jù)實驗動物國家標準，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測程序為：無菌操作下取回盲部內(nèi)容物、糞便或肛拭子，接種于CIN-1或改良Y瓊脂平皿，置25 ℃培養(yǎng)48 h，觀察平皿上是否有邊緣半透明或透明，中心呈深紅色，表面濕潤突起的“牛眼狀”菌落，如有可疑菌落，需要純培養(yǎng)后進行生化鑒定，生化鑒定可以選擇全自動細菌鑒定儀，也可以選擇生化條，或者根據(jù)國標中的生化項目進行檢測均可以得出準確的結(jié)論。

從NIFDC-PT-173實驗動物腸道中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢測能力驗證計劃結(jié)果報告中可以看出，本次能力驗證計劃參加實驗室共有24家，其中23家實驗室在規(guī)定時間內(nèi)提交了結(jié)果反饋單，1家沒有及時提交結(jié)果反饋單。其中判定為滿意結(jié)果的有22家，占91.7%，不滿意結(jié)果有2家，占8.3%。實驗動物質(zhì)量檢測機構對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測能力很高。本次能力驗證不規(guī)定檢測方法，參加單位中有6家采用了不止2種檢測方法，有2家單位使用了PCR方法進行檢測并準確的檢測出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，20家均采用了生化鑒定法，實驗室449未及時反饋結(jié)果，判為不滿意，實驗室887將陰性樣本檢測為陽性，判為不滿意，查驗了該單位的檢測報告，考慮可能是因為初次接種樣本時污染或接錯等導致鑒定結(jié)果不準確。

本次能力驗證活動采用生化鑒定的單位中有9家沒有生化管來源及批號信息，要求檢測報告中應含有完整的試劑信息。在參加單位中，有2家單位寄回的紙質(zhì)材料中沒有原始記錄，所以無法判斷這2家單位用的何種檢測方法。除去能力驗證的要求，附原始記錄對參加單位是有好處的，比如結(jié)論填報錯誤但原始記錄結(jié)果正確，這種情況會聯(lián)系該單位要求其改正結(jié)論，如果沒有原始記錄即只能判定該單位結(jié)果不滿意。

綜上所述，本次能力驗證的實施有助于實驗動物質(zhì)量檢測實驗室在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢測過程中發(fā)現(xiàn)自身的問題，并且針對性的予以解決，達到提高自身檢測能力的目的，最終提升實驗動物質(zhì)量水平，保障實驗動物和動物實驗的安全和效果。