趙電波，王少丹，鄭凱茜，相啟森，王博華，張琪帆

（1.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，河南鄭州 450001；2.河南省冷鏈食品質(zhì)量與安全控制重點實驗室，河南鄭州 450001）

等離子體活化水（Plasma-activated water，PAW）又稱為等離子體處理水（Plasma-treated water，PTW），主要通過低溫等離子體放電裝置在水表面或水下放電而產(chǎn)生，富含活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）等物質(zhì)。PAW 是一種新興的非熱殺菌技術(shù)，在食品保鮮領(lǐng)域具有廣泛的應用前景[1]。但研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等食品組分會顯著降低PAW 對微生物的殺滅效果，因此需要和溫熱、防腐劑、表面活性劑等協(xié)同使用以增強殺菌效果[2-7]。Choi 等[5]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PAW和60 ℃溫熱協(xié)同處理后，腌制白菜中的菌落總數(shù)和接種的食源性致病菌數(shù)量均顯著減少。此外，PAW與尼泊金丙酯等防腐劑聯(lián)合使用時其殺菌效果也顯著增強[6-7]。例如，PAW 和4 mmol/L 尼泊金丙酯聯(lián)合處理10 min 后，大腸桿菌O157:H7 減少了6 lg CFU/mL，而PAW 和尼泊金丙酯單獨處理組僅分別降低了1.54 和2.18 lg CFU/mL[6]。

苯乳酸（Phenyllactic acid，PLA）又名β-苯基乳酸或3-苯基乳酸，是一種具有廣譜抑菌作用的生物防腐劑，對細菌和大部分真菌具有良好的抑制作用[8-9]。與傳統(tǒng)化學防腐劑相比，PLA 具有安全性高、來源廣泛、穩(wěn)定性強、親水性好等優(yōu)點。已有報道證實PLA 可降低乳制品、焙烤類食品中的微生物數(shù)量，其在食品保鮮領(lǐng)域的應用受到廣泛關(guān)注[10-11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，PAW 與PLA 有良好的協(xié)同殺菌效果，但其作用機制尚不明確。因此，本研究以常見的大腸桿菌O157:H7 為研究對象，評價PAW 與PLA 的協(xié)同抗菌作用，并通過評價細胞形態(tài)、細胞膜完整性、細胞膜電位和胞內(nèi)活性氧水平等指標揭示其協(xié)同殺菌作用機制。研究結(jié)果將為PAW 和PLA 在食品保鮮領(lǐng)域中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌O157:H7 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（Tryptone soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（Tryptone soy broth，TSB） 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；L-苯乳酸和DiBAC4（3） 上海麥克林生化科技有限公司；乙酸異戊酯和磷酸二氫鉀 天津市科密歐化學試劑有限公司；50%戊二醛 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）上海源葉生物科技有限公司。

TS-PL200 型等離子表面處理機 深圳東信高科自動化設(shè)備有限公司；MJ-54A 型高壓滅菌鍋 施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；TGL-16M 型臺式高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺 蘇凈安泰設(shè)備有限公司；Tecan Spark 20 M 型多功能微孔板讀數(shù)儀 瑞士Tecan 公司；JSM-7001F 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本JEOL 公司；Nano Drop 2000 型超微量分光光度計 美國Thermo 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備 從-80 ℃冰箱中取出甘油管保存的大腸桿菌O157:H7 菌種，挑取一環(huán)菌液在TSA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)后，挑取活力旺盛的單菌落接種于TSB 培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。取7 mL 培養(yǎng)物于10 mL 離心管，于3500×g離心5 min，棄上清液，所得菌體用0.85%無菌生理鹽水洗滌2次，離心同上。將所得菌體重懸于無菌生理鹽水中并混勻，制成活菌數(shù)約為7～8 lg CFU/mL的菌懸液，備用。

1.2.2 PAW 的制備 參考Zhang 等[12]的方法，采用等離子表面處理機制備PAW，冷等離子體與液面的距離為0.35 cm，功率為750 W，工作氣體為壓縮空氣（0.18 MPa）。將200 mL 無菌去離子水（Sterile distilled water，SDW）經(jīng)APPJ 裝置處理60 s 得到PAW，備用。

1.2.3 PLA 殺菌活性評價 將PLA 溶解于去離子水并經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，并稀釋到1.25、2.5、5 和10 mg/mL。然后將100 μL菌懸液、800 μL 0.85%無菌生理鹽水和100 μL PLA溶液充分混勻，PLA 最終濃度分別為0.125、0.25、0.5 和1.0 mg/mL，于室溫反應8 min。取100 μL 處理后的樣品，用無菌生理鹽水進行梯度稀釋后，吸取100 μL 稀釋液涂布于TSA 平板并于37 ℃培養(yǎng)24 h，進行菌落計數(shù)，結(jié)果表示為lg CFU/mL。

1.2.4 PAW 協(xié)同PLA 殺菌活性評價 研究PAW協(xié)同PLA 處理對大腸桿菌O157:H7 的影響。根據(jù)前期預實驗結(jié)果，分組如下：

a. 對照組：將100 μL 菌懸液、100 μL SDW 與800 μL 無菌生理鹽水混合均勻，于室溫反應8 min；

b. PAW 單獨處理：將100 μL 菌懸液、100 μL無菌生理鹽水與800 μL PAW 混合均勻，于室溫反應8 min；

c. PLA 單獨處理：將100 μL 菌懸液、100 μL PLA溶液和800 μL 無菌生理鹽水混合均勻，PLA 最終濃度分別為0.125、0.25、0.5 和1.0 mg/mL，于室溫反應8 min；

d. PAW 協(xié)同PLA 處理：將100 μL 菌懸液、100 μL PLA 溶液和800 μL PAW 混合均勻，PLA 最終濃度分別為0.125、0.25、0.5 和1.0 mg/mL，于室溫反應8 min。

1.2.5 場發(fā)射掃描電鏡觀察 參考劉驍?shù)萚13]的方法，采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Field emission scanning electron microscope，F(xiàn)ESEM）觀察PAW 協(xié)同PLA 處理對大腸桿菌O157:H7 細胞形態(tài)的影響。菌懸液經(jīng)PAW、PLA（1.0 mg/mL）或PAW 協(xié)同PLA（1.0 mg/mL）處理8 min 后，于12000×g 離心2 min，收集菌體，加入500 μL 預冷的2.5%戊二醛溶液并于4 ℃固定4 h；離心收集菌體，用濃度為0.1 mol/L 的無菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）洗滌樣品三次，離心同上；分別用30%、50%、70%、80%、90%和100%（v/v）乙醇溶液對樣品逐級洗脫10 min，其中100%乙醇溶液洗脫2次；最后用乙酸異戊酯置換乙醇2次，每次10 min，離心條件同上，制備菌懸液，混勻之后滴加到載玻片上，自然晾干，采用HVBGB 型真空蒸鍍儀噴金150 s，通過JSM-7001F 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

1.2.6 細胞膜完整性評價 大腸桿菌O157:H7 菌懸液分別經(jīng)PAW、PLA（終濃度分別為0.125、0.25、0.5 和1.0 mg/mL）或PAW 協(xié)同PLA（終濃度分別為 0.125、0.25、0.5 和 1.0 mg/mL）8 min 后，在12000×g 和4 ℃條件下離心2 min，采用Nano Drop 2000 型超微量分光光度計測定上清液在280 nm 處的吸光度[14]。

1.2.7 細胞膜電位測定 大腸桿菌O157:H7 細胞分別經(jīng)PAW、PLA（1.0 mg/mL）或PAW 協(xié)同PLA（1.0 mg/mL）處理8 min 后，離心收集菌體。處理后所得菌體與100 μL（25 μg/mL）DiBAC4（3）溶液和900 μL EDTA 溶液（4 mmol/L）混合均勻，置于37 ℃暗處培養(yǎng)15 min，離心，棄上清液。菌體用PBS 洗滌2次并重懸，采用多功能微孔板讀數(shù)儀測定熒光強度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射光波長為525 nm，以未處理的樣品為空白對照[15]。

1.2.8 胞內(nèi)ROS 水平測定 采用DCFH-DA 熒光探針檢測大腸桿菌O157:H7 細胞內(nèi)ROS 水平[16]。菌懸液分別經(jīng)PAW、PLA（終濃度分別為0.125、0.25、0.5 和1.0 mg/mL）或PAW 與PLA（終濃度分別為0.125、0.25、0.5 和1.0 mg/mL）協(xié)同處理8 min 后，于4 ℃，12000×g 離心2 min，棄上清，收集菌體并用SDW 洗滌兩次，后重懸于無菌生理鹽水，加入DCFHDA 儲備液（終濃度為50 μmol/L）于37 ℃避光反應30 min；然后于12000×g 離心2 min，棄上清，收集菌體并用PBS 洗滌兩次，重懸后采用多功能酶標儀測定熒光強度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次試驗均重復3次，試驗結(jié)果表示為平均值±標準差。采用Prism 軟件（Graphpad 7.0）繪圖，采用SPSS 24.0 進行單因素方差分析（one-way ANOVA），各組間采用LSD 多重比較進行差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLA 處理對大腸桿菌O157:H7 的影響

通過平板計數(shù)法評價不同濃度PLA 處理對大腸桿菌O157:H7 細胞活力的影響。如圖1所示，大腸桿菌O157:H7 初始菌量為7.41 lg CFU/mL；經(jīng)終濃度為0.125～1.0 mg/mL 的PLA 處理后，大腸桿菌O157:H7 活細胞數(shù)未發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。與對照組相比，經(jīng)終濃度為1.0 mg/mL 的PLA 處理后，大腸桿菌O157:H7 菌落數(shù)僅下降0.18 lg CFU/mL。上述結(jié)果與Ning 等[17]的發(fā)現(xiàn)一致。Ning 等[17]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)濃度為1.25 mg/mL 的PLA 處理2 h 后，大腸桿菌僅下降了約1 lg CFU/mL。以上結(jié)果表明，低濃度（0.125～1.0 mg/mL）的PLA 未對大腸桿菌O157:H7細胞活力造成顯著影響（P＞0.05）。

圖1 PLA 對大腸桿菌O157:H7 的影響Fig.1 Influences of PLA on E. coli O157:H7 cells

2.2 PAW 協(xié)同PLA 處理對大腸桿菌O157:H7 的殺滅作用

PAW 協(xié)同PLA（終濃度為0.125～1.0 mg/mL）處理對大腸桿菌O157:H7 的殺滅作用見圖2。如圖2所示，大腸桿菌O157:H7 初始濃度為7.51 lg CFU/mL；經(jīng)PAW 單獨處理8 min 后，細胞數(shù)量僅下降了1.07 lg CFU/mL，表明PAW 對大腸桿菌O157:H7 的失活作用較弱。與PAW 或PLA 單獨處理相比，PAW 與PLA 協(xié)同處理能夠有效殺滅大腸桿菌O157:H7。經(jīng)PAW 與終濃度分別為0.125、0.25、0.5 和1.0 mg/mL的PLA 協(xié)同處理8 min 后，大腸桿菌O157:H7 菌落數(shù)分別減少了1.17、1.76、1.92 和5.65 lg CFU/mL（P＜0.05）。此外，Liu 等[18]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)0.5% PLA 或余氯含量為30 mg/L的微酸性電解水（slightly acid electrolyzed water，SAEW）單獨處理5 min 后，產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）分別降低了5.8 和0.7 lg CFU/mL；而經(jīng)0.5% PLA 與SAEW（余氯含量為30 mg/L）協(xié)同處理5 min 后，K. oxytoca由初始的8.0 lg CFU/mL降低至1.4 lg CFU/mL 以下。以上結(jié)果表明，PAW與PLA 協(xié)同處理能夠有效殺滅大腸桿菌O157:H7，且其殺滅效能隨PLA 濃度的升高而增強。

圖2 PAW 協(xié)同PLA 處理對大腸桿菌O157:H7 的殺滅作用Fig.2 Inactivation of E. coli O157:H7 cells by PAW combined with PLA

2.3 PAW 協(xié)同PLA 處理對大腸桿菌O157:H7 的細胞形態(tài)的影響

采用場發(fā)射掃描電鏡評價PAW 協(xié)同PLA 處理對大腸桿菌O157:H7 細胞形態(tài)的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可知，對照組大腸桿菌呈現(xiàn)為規(guī)則的桿狀，細胞大小較為均勻，表面完整光滑；經(jīng)PAW 或PLA（1.0 mg/mL）單獨處理后，大腸桿菌菌體均出現(xiàn)輕微的皺縮，表面變得粗糙。寧亞維等[19]也發(fā)現(xiàn)經(jīng)PLA（1.25 mg/mL）處理1 h 后，大腸桿菌細胞發(fā)生凹陷等變化。經(jīng)PAW 和PLA（1.0 mg/mL）協(xié)同處理后，大腸桿菌細胞表面出現(xiàn)明顯的褶皺和塌陷。以上結(jié)果表明，PAW 和PLA 協(xié)同處理顯著破壞了大腸桿菌的細胞形態(tài)，可能進一步影響其正常生理代謝，最終導致其失活。

圖3 PAW 協(xié)同PLA 處理對大腸桿菌O157:H7細胞形態(tài)的影響Fig.3 Effect of PAW treatment combined with PLA on the morphology of E. coli O157:H7 cells

2.4 PAW 協(xié)同PLA 處理對大腸桿菌O157:H7 細胞膜完整性的影響

細胞膜可保護細菌免受周圍環(huán)境的影響，并為細菌的生長和代謝輸送必需的營養(yǎng)物質(zhì)[20]。因此，細胞膜完整性對于維持細胞穩(wěn)態(tài)和生長繁殖具有重要意義[21]。本研究通過測定胞內(nèi)蛋白質(zhì)的釋放評價PAW 與PLA 協(xié)同處理對大腸桿菌O157:H7 細胞膜完整性的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 PLA 單獨（A）或PAW 協(xié)同PLA 處理（B）對大腸桿菌O157:H7 蛋白釋放量的影響Fig.4 Effect PLA alone (A) or PAW treatment combined with PLA (B) on leakage of proteins from E. coli O157:H7 cells

如圖4所示，與對照組相比，PAW 與PLA 單獨處理組大腸桿菌胞外蛋白含量均顯著升高（P＜0.05）。如圖4A 當濃度為0.125～1.0 mg/mL 時，PLA 單獨處理組大腸桿菌胞外蛋白含量隨著PLA 濃度的升高而顯著升高（P＜0.05）。上述結(jié)果與Sorrentino 等[22]的研究報道一致。Sorrentino 等[22]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)終濃度為11.3 mmol/L 的PLA 處理5 h 后，李斯特菌（Listeria innocua）胞內(nèi)物質(zhì)釋放量與對照組相比顯著升高（P＜0.05）。與PAW 或PLA 單獨處理相比，PAW 與PLA協(xié)同處理組大腸桿菌胞外蛋白質(zhì)含量明顯升高。經(jīng)PAW 與PLA（1.0 mg/mL）協(xié)同處理后，上清液在280 nm 處吸光度升高至0.266，顯著高于PAW 單獨處理組（A280=0.041）或PLA 單獨處理組（A280=0.107）。以上結(jié)果表明，PAW 協(xié)同PLA 處理破壞了大腸桿菌O157:H7 的細胞膜完整性并導致蛋白質(zhì)、DNA等胞內(nèi)組分的泄露，這可能是其殺滅大腸桿菌細胞的重要機制。

2.5 PAW 協(xié)同PLA 處理對大腸桿菌O157:H7 細胞膜電位的影響

細菌膜電位在調(diào)節(jié)pH 穩(wěn)態(tài)、跨膜運輸、鞭毛運動、細胞分裂和ATP 合成等多種生理功能中發(fā)揮著重要作用[23]。DiBAC4（3）是一種對膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料，本身無熒光；當進入去極化細胞后與細胞內(nèi)富含脂質(zhì)成分結(jié)合而使細胞內(nèi)的熒光強度增強[24]，因此被廣泛用于評價細胞膜電位的變化。PAW 協(xié)同不同濃度PLA 處理對大腸桿菌O157:H7 細胞膜電位的影響見圖5。

圖5 PAW 協(xié)同PLA 處理對大腸桿菌O157:H7細胞膜電位的影響Fig.5 Effect of PAW treatment combined with PLA on the membrane potential of E. coli O157:H7 cells

由圖5可知，與對照組相比，經(jīng)PAW 與PLA（1.0 mg/mL）協(xié)同處理8 min 后，大腸桿菌O157:H7細胞中DiBAC4（3）熒光強度均顯著升高（P＜0.05）。經(jīng)PAW 和PLA（1.0 mg/mL）協(xié)同處理后，大腸桿菌O157:H7 中DiBAC4（3）熒光強度較對照組提高了74.9%，顯著高于PAW 單獨處理組（僅提高了16.1%）和PLA 單獨處理組（提高了29.0%）（P＜0.05）。此外，Liu 等[6]報道，經(jīng)PAW 與尼泊金丙酯協(xié)同處理10 min 后，大腸桿菌O157:H7 細胞中DiBAC4（3）熒光強度比對照組提高了505.6%，顯著高于PAW 單獨處理組（提高了34.6%）和尼泊金丙酯單獨處理組（提高了208.5%）。Wang 等[25]也有類似的發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PLA（1.25、2.5、5 和10 mg/mL）處理5 h 后，糞腸球菌（Enterococcus faecalis）細胞膜發(fā)生去極化，進而影響其ATP 的產(chǎn)生和物質(zhì)的跨膜運輸。上述結(jié)果表明，PAW 和PLA 協(xié)同處理導致大腸桿菌O157:H7細胞膜發(fā)生去極化，進而干擾各種新陳代謝途徑，從而導致細胞死亡。綜上所述，細胞膜可能是PAW和PLA 協(xié)同作用的主要靶點。

2.6 PAW 協(xié)同PLA 處理對大腸桿菌O157:H7 胞內(nèi)ROS 水平的影響

采用DCFH-DA 探針檢測PAW 與PLA 協(xié)同處理對大腸桿菌O157:H7 細胞內(nèi)ROS 水平的影響，結(jié)果見圖6。如圖6所示，與對照組相比，經(jīng)終濃度為1.0 mg/mL 的PLA 處理8 min 后，大腸桿菌O157:H7胞內(nèi)ROS 水平僅升高了23.0%（P＜0.05）；經(jīng)PAW 單獨處理8 min 后，大腸桿菌O157:H7 胞內(nèi)ROS 水平僅升高了4.59 倍（P＜0.05）。經(jīng)PAW 協(xié)同PLA 處理后，大腸桿菌O157:H7 細胞內(nèi)ROS 水平隨PLA 濃度的增加而逐漸升高。與對照組相比，經(jīng)PAW 與終濃度為0.25、0.5 和1.0 mg/mL 的PLA 協(xié)同處理后，大腸桿菌O157:H7 胞內(nèi)ROS 水平分別升高了7.38、7.91 和9.53 倍（P＜0.05）。研究證實，PAW 中含有過氧化氫（H2O2）、臭氧（O3）、過氧亞硝基陰離子（ONOO-）、NO2-、NO3-等活性物質(zhì)[26-27]。這些活性物質(zhì)誘導細菌細胞膜中的脂質(zhì)發(fā)生氧化反應，同時活性物質(zhì)還可以滲透到細胞內(nèi)，對細胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)造成氧化損傷，誘導細胞發(fā)生氧化應激，進而破壞細胞的正常生理功能[28-30]。綜上所述，經(jīng)PAW與PLA 協(xié)同處理會導致ROS 的過度積累，可能會對大腸桿菌O157:H7 胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 等物質(zhì)造成氧化損傷，導致細胞膜和生理功能被破壞，最終造成細胞死亡。

圖6 PLA 單獨（A）或PAW 協(xié)同PLA 處理（B）對大腸桿菌O157:H7 細胞內(nèi)ROS 水平的影響Fig.6 Effect PLA alone (A) or PAW treatment combined with PLA (B) on intracellular ROS levels of E. coli O157:H7

3 結(jié)論

綜上所述，PAW 與PLA 協(xié)同處理能夠有效殺滅大腸桿菌O157:H7，且其殺菌效能隨PLA 濃度的升高而增強。經(jīng)PAW 與終濃度為1.0 mg/mL 的PLA 協(xié)同處理8 min 后，大腸桿菌O157:H7 減少了5.65 lg CFU/mL。PAW 與PLA 協(xié)同處理后，大腸桿菌O157:H7 細胞形態(tài)發(fā)生明顯皺縮，細胞膜通透性增強、細胞膜發(fā)生去極化且胞內(nèi)ROS 水平顯著升高，推測PAW 與PLA 可能通過破壞細胞膜和誘導氧化應激等途徑發(fā)揮協(xié)同抗菌作用。在今后的研究中應綜合運用代謝組學、蛋白質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學等方法系統(tǒng)闡明PAW 與PLA 協(xié)同處理失活微生物的分子機制；此外，還應系統(tǒng)評價PAW 與PLA 協(xié)同處理對食品表面微生物的殺滅效果及對食品營養(yǎng)、感官及貨架期等指標的影響。